前言

       癲癇是發(fā)病率的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，全世界有超過5000萬人患有癲癇。發(fā)達國家的發(fā)病率約為每年40-70/10萬人。在目前的治療中，大約2/3的癲癇患者沒有發(fā)生癲癇發(fā)作，但是對于另外的1/3癲癇患者，盡管已有數(shù)種抗癲癇藥物(AEDs)可供使用，但仍然沒有得到很好的控制。因此在癲癇治療領域始終也我們在一直期盼著更加有效的新藥的出現(xiàn)。

       左乙拉西坦(Levetiracetam，簡稱LEV)是繼續(xù)卡馬西平、苯妥英鈉、丙戊酸鈉等傳統(tǒng)抗癲癇藥物之后的由比利時UCB公司開發(fā)的第二代新型抗癲癇藥物(商品名Keppra?)。1999年12月正式批準用于16歲以上成人部分發(fā)作的輔助治療，2005年6月又將適應癥擴大到4歲以上兒童。左乙拉西坦憑借其獨特的作用機制，對于成人癲癇部分發(fā)作治療效果獲得了肯定，且耐受性良好。

       2016年1月14日和2016年2月18日歐洲醫(yī)藥管理局(EMA)和美國食品藥品管理局(FDA)分別于批準了比利時UCB公司開發(fā)的第三代抗癲癇藥物—布瓦西坦(Brivaracetam，簡稱BRV)，商品名為Briviact?。用于治療16歲及以上部分發(fā)作型的癲癇患者，輔助治療伴隨或不伴隨繼發(fā)全身性發(fā)作。

       BRV和LEV的結構非常相似，都屬于吡咯烷酮衍生物。BRV與LEV的化學結構相比，僅僅是在吡咯烷烴的4位上連接了一個正丙基。兩個藥物就像雙子座一樣相似，以至于第一次見到BRV時，誤為這是一個偽創(chuàng)新產(chǎn)品，或者UCB公司為了延續(xù)LEV產(chǎn)品所來帶的市場輝煌所做的延續(xù)性產(chǎn)品，且不論判斷的正誤或者研發(fā)的動機，BRV的發(fā)現(xiàn)背后還是存在著深入的藥理機制研究，本文也正是想透過BRV的非臨開發(fā)歷程和與LEV的對比優(yōu)勢來透視此類新型抗癲癇藥物獨特的發(fā)現(xiàn)。

       SV2A蛋白靶點的發(fā)現(xiàn)和認知對于新型抗癲癇藥物開發(fā)的意義

       LEV已經(jīng)上市數(shù)十年，但事實上LEV對于常用的篩選新化合物的經(jīng)典動物模型沒有作用，這與其臨床有效性相矛盾。因此LEV的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)引起了對當時開發(fā)研究方法的一些懷疑，并且增加了在這個研究領域的爭論。

       在BRV開發(fā)之前，作為LEV和BRV靶點的SV2A蛋白的作用還遠遠沒有被完全理解。然而，BRV的開發(fā)證明了SV2A蛋白結合親和力與抗癲癇作用之間的相關性，并且提高了此類抗癲癇藥物成功開發(fā)的可能性。SV2A蛋白的鑒定和隨后的臨床前癲癇研究方法是影響該領域進展的一個里程碑，具有相當重大的意義。BRV的有效性也進一步強化了對這一觀點和對新方法的需求。

       SV2A蛋白的發(fā)現(xiàn)和BRV的后續(xù)開發(fā)進一步證實了這樣一種印象：在過去的20年中，新的AEDs沒有一個能夠提高癲癇治愈患者的比例，是因為目前的藥物開發(fā)所采用的相同動物模型幾乎都是基于相同的假設和理論基礎。因此，為了探索新的目標藥物，迫切需要新創(chuàng)新的癲癇臨床前開發(fā)模型。

       1. SV2A蛋白的發(fā)現(xiàn)叩開了新型癲癇藥物開發(fā)的大門

       SV2蛋白是存在于神經(jīng)元和內分泌細胞突觸囊泡中的原型蛋白質，具有12-跨膜結構，并由三種亞型SV2A、SV2B和SV2C組成。在SV2亞型中，SV2A在包括大腦皮層、海馬和小腦在內的所有腦區(qū)域高度表達，但是也由神經(jīng)內分泌細胞和神經(jīng)肌肉接頭表達，已有研究結果表明SV2A可以調節(jié)突觸小泡的胞吐作用和突觸前神經(jīng)遞質的釋放。

       BRV的發(fā)現(xiàn)和非臨床開發(fā)與SV2A蛋白的發(fā)現(xiàn)有著緊密的聯(lián)系，也與第一種顯示與SV2A蛋白結合的AED藥物LEV的發(fā)現(xiàn)有緊密的聯(lián)系。在非臨床研究中，LEV在癲癇發(fā)作模型中顯示出對聽源性和點燃性癲癇發(fā)作、6-Hz電休克和棘波放電具有保護作用。但在用于AED發(fā)現(xiàn)的標準動物模型——電休克(MES)和戊四氮(PTZ)的模型中顯示出無效。LEV的非臨床特征與臨床研究顯示的廣譜有效性雖然相關，但其非典型抗癲癇特性表明LEV具有與傳統(tǒng)AED不同的作用機制。相關研究隨后揭示了LEV與SV2A蛋白的可逆的，飽和的和立體選擇性的結合，導致突觸小泡的胞吐減少和興奮性突觸中癲癇活動期間誘發(fā)率降低的增加。從那時起，研究集中在發(fā)現(xiàn)靶向SV2A蛋白的新藥物上，最終導致BRV的開發(fā)。

       2. SV2A蛋白是抗癲癇藥物的潛在好靶點

       一些動物研究表明，SV2A蛋白是控制癲癇發(fā)作的一個潛在好靶點。

       SV2A敲除小鼠不能生長和產(chǎn)生自發(fā)性癲癇發(fā)作，會在出生后2-3周內死亡。而雜合性SV2A敲除小鼠不顯示自發(fā)性癲癇發(fā)作，而顯示預癲癇特征，例如增強了對毛果蕓香堿和卡因酸(Kainate)預驚厥作用的敏感性，減少6-Hz癲癇發(fā)作的閾值和角膜點燃的增加率。對來自SV2A敲除小鼠的培養(yǎng)的神經(jīng)元的研究表明由于較低的初始囊泡釋放概率和刺激期間神經(jīng)遞質釋放的減少，突觸后反應降低。

       在癲癇發(fā)作的動物模型和從癲癇患者獲得的腦組織中發(fā)現(xiàn)了SV2A蛋白表達和功能改變，這表明SV2A蛋白表達/功能的降低促成了癲癇的進展。

       SV2A蛋白的結合與不同癲癇發(fā)作的非臨床模型(如聽覺癲癇發(fā)作小鼠)中的抗癲癇作用緊密相關，并且SV2A蛋白水平的下降似乎還涉及耐藥性癲癇的機制。

       所有這些證據(jù)一起表明，SV2A蛋白明確涉及癲癇的發(fā)病機制，因此可以在其治療中發(fā)揮作用。然而，SV2A的詳細功能和機制(例如神經(jīng)遞質特異性)仍不清楚。

       BRV的發(fā)現(xiàn)歷程

       正如已經(jīng)提到的那樣，SV2A蛋白作為LEV主要分子靶標的發(fā)現(xiàn)以及隨后對于癲癇治療潛在作用的證據(jù)促成了SV2A機制新藥的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化程序。

       新的目標是確定比LEV能更完全抑制癲癇發(fā)作的高選擇性和更有效的SV2A配體。在體外篩選了約12000種化合物的SV2A結合親和力，進一步篩選了其中的1200種化合物對體內驚厥發(fā)作易感小鼠的癲癇發(fā)作保護作用。最后選擇了約30個化合物，并在不同的癲癇動物模型中進行了大量表征。這些研究發(fā)現(xiàn)，LEV吡咯烷環(huán)4位上的取代可以增強結合親和力。在對這個位點進行基團替換的系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，與LEV相比，各種小的疏水基團具有更強的SV2A親和力。并且在聽覺癲癇發(fā)作試驗中增強了活性。在具有增強結合親和力的類似物中，最終選擇了分子量為212的與LEV結構相近的2-吡咯烷酮衍生物BRV作為藥物開發(fā)候選物。

       BRV的非臨床特點

       1. BRV具有更高的SV2A蛋白選擇性和結合力

       BRV是具有SV2A高度選擇性和可逆性的配體，具有優(yōu)于LEV的抑制突觸傳遞和囊泡釋放的親和能力。此外，來自SV2A敲除小鼠的研究結果顯示，直至600nM(測試的濃度)的濃度，[3H]BRV具有僅標記SV2A蛋白的高度選擇性。大鼠和人腦中[3H]BRV的體外結合顯示，BRV對大鼠和人SV2A顯示出了與LEV類似的親和力(Kd為62nM)；然而對應于在癲癇動物模型和人腦切片研究中的突觸前SV2A，BRV對于突觸后SV2A顯示出比LEV高出約15-30倍的親和力。在治療相關劑量下，BRV占據(jù)大腦中SV2A的80％至>90％。小鼠腦中的離體結合實驗顯示，BRV在給藥后5-15分鐘內達到SV2A占有率，在該時間范圍內也顯示出對癲癇發(fā)作的保護作用。

       2. BRV具有更快的腦部滲透速度

       BRV具有比LEV (LogD 0.64)更高的親脂性(LogD 1.04)，導致更快的腦部滲透速度，這與癲癇發(fā)作小鼠模型中的快速保護作用相對應。LEV的預測藥物進入半衰期為23分鐘，而BRV僅為3分鐘，在藥物滲透入腦的速度上觀察到約7倍的差異。同樣，在相同聽覺小鼠模型中的離體結合研究顯示，BRV腹膜內(i.p.)給藥后5-15分鐘內觀察到SV2A的占有率和活性，而LEV為30-60分鐘。因此，可以更快進入大腦的BRV具有較短的作用潛伏期，這對于例如癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)或癲癇集群性發(fā)作的臨床緊急治療情況具有十分重要的意義。

       3. BRV具有更低的有效劑量

       使用高頻神經(jīng)元刺激來比較BRV和LEV的大鼠海馬切片研究表明，BRV增強突觸抑制，并且可以在比LEV低100倍的濃度下來減少突觸傳遞。另外，BRV在減少突觸小泡動員方面比LEV更有效。

       4. BRV具有更高的治療指數(shù)

       BRV雖然顯示出低的治療指數(shù)(在完全點燃發(fā)作動物的旋轉桿測試中運動損傷的TD50與在相同動物中針對廣義運動癲癇發(fā)作保護的ED50之間的比率)，但仍然比LEV高(148比46)。在杏仁核點燃大鼠的旋轉試驗中，BRV具有比LEV更高的治療指數(shù)(4比2)。然而，它明顯高于經(jīng)典的和其他新型抗癲癇藥物(治療指數(shù)從2到21)。

       5. BRV具有更強的抗癲癇潛力和有效性

       體外研究表明，在兩個不同的體外大鼠海馬切片癲癇模型中，BRV具有比LEV更強的抗癲癇潛力和有效性，其劑量范圍與其臨床有效性相關。與LEV相比，BRV對SV2A親和力的增加與在不同的癲癇體內模型中觀察到的對癲癇保護作用的顯著有效性相關。BRV的有效性已經(jīng)在包括聽覺小鼠、斯特拉斯堡(GAERS)遺傳失神癲癇大鼠、杏仁核和角膜點燃模型以及缺氧后肌肉細胞的大鼠模型的部分和全面癲癇發(fā)作模型中進行了研究。在這些模型中，BRV始終如一地表現(xiàn)出比LEV更有效和更全面的抑制癲癇發(fā)作。特別是，在杏仁核鼠中，BRV (6.8-210mg/kg)劑量依賴性地降低癲癇發(fā)作嚴重性，在測試劑量下幾乎完全抑制了癲癇發(fā)作。相比之下，即使在高劑量下，LEV (17-540mg/kg)也僅能提供有限的保護。在完全杏仁核點燃的大鼠中，BRV還能更全面地抑制運動發(fā)作的嚴重程度和放電后的持續(xù)時間。特別是，BRV對于嚴重運動發(fā)作的抑制劑量為21.2mg/kg，而LEV只有達到170mg/kg的劑量才能產(chǎn)生類似效果。在測試劑量(212.3mg/kg)下，BRV也顯著降低后續(xù)放電持續(xù)時間，而LEV即使超過1700mg/kg，對此指標也沒有任何影響。

       6. SV2A蛋白相互作用的個體差異

       在幾種癲癇動物模型中，BRV與LEV相比所具有的更高有效性也可能是由于與SV2A蛋白相互作用的個體差異。事實上，使用SV2A變構調節(jié)劑的研究表明，BRV與SV2A的相互作用不同于LEV，BRV可能會誘導或穩(wěn)定不同的SV2A蛋白質構象，這可能提供BRV與LEV相比所不同藥效學性質的分子原理。實際上，LEV和BRV作用于不同的結合位點或與SV2A蛋白具有不同構象狀態(tài)的相互作用。這可能解釋了來自大鼠海馬切片的電生理學研究的發(fā)現(xiàn)，其顯示BRV具有更大的抑制突觸傳遞和囊泡釋放能力。

       小結

       BRV已經(jīng)在許多癲癇實驗模型中顯示出優(yōu)異的抗癲癇活性，并且作為疾病改善作用方面具有一定的前景。臨床前研究表明，與LEV相比，BRV具有更高的有效性，因為其具有更高的選擇性，更高的親和力和不同于SV2A的結合特性，以及與更快速的腦滲透相關的親脂性。正是基于這些研究發(fā)現(xiàn)，觸發(fā)了進一步臨床開發(fā)BRV的決定。雖然目前尚無臨床研究支持BRV優(yōu)于LEV有效性的證據(jù)，我們也期待著BRV與LEV的頭對頭臨床研究來確證BRV的臨床優(yōu)勢。

       參考文獻

       Emilio Russo, Rita Citraro & Marco Mula (2017) The preclinical discovery and development of brivaracetam for the treatment of focal epilepsy, Expert Opinion on Drug Discovery, 12:11, 1169-1178, DOI: 10.1080/17460441.2017.1366985