淺談細(xì)胞培養(yǎng)代謝副產(chǎn)物——乳酸和銨

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作者：知行來源：CPhI制藥在線

2018-01-03

乳酸和銨是細(xì)胞培養(yǎng)過程中不可避免的兩種代謝副產(chǎn)物，兩者的累積都是不想看到的，因為這兩種代謝副產(chǎn)物積累會影響到細(xì)胞生長、蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量等。文中筆者對乳酸和銨影響細(xì)胞生長的緣由，以及如何降低兩者的細(xì)胞**進行了簡要概述。

細(xì)胞培養(yǎng)

乳酸

CHO細(xì)胞培養(yǎng)前期往往有少量的乳酸積累，特別是在細(xì)胞代謝旺盛的對數(shù)生長期，一般情況下細(xì)胞都可以將這些乳酸代謝消耗掉。但有時這對于某些細(xì)胞株并不順利，乳酸的累積對細(xì)胞是致命的。乳酸主要來源于葡萄糖的不完全氧化，乳酸的累積會使體系pH降低，為使pH回升添加的堿液往往會增加體系的滲透壓，從而影響細(xì)胞正常生長代謝。而如果不加堿液調(diào)節(jié)pH，低pH環(huán)境對于細(xì)胞體內(nèi)的酶不是個好消息，酶活的降低會限制細(xì)胞代謝，影響細(xì)胞生長。

為解除乳酸對細(xì)胞生長及蛋白產(chǎn)量的影響，可以考慮構(gòu)建對環(huán)境壓力耐受性高的細(xì)胞株，也可對細(xì)胞培養(yǎng)策略進行優(yōu)化。用代謝緩慢的糖類代替葡萄糖作為碳源可以降低乳酸的累積，如半乳糖、巖藻糖和麥芽糖的使用。而當(dāng)乳酸有一定累積時，可以通過葡萄糖的濃度來改變細(xì)胞的代謝路徑，改葡萄糖代謝為乳酸代謝，從而減少乳酸累積，但低糖消耗乳酸的策略對蛋白質(zhì)量的影響并不明確。對細(xì)胞進行基因改造也可以降低乳酸累積，如刪除乳酸脫氫酶（LDH）基因、擴增丙酮酸羧化酶（PYC2）基因等。其中LDH是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶，PYC2是參與將乳酸、丙酮酸、氨基酸及甘油轉(zhuǎn)化生成葡萄糖的催化酶，對兩者的基因改造可在代謝通路減少乳酸累積。

上述的方法雖然可降低乳酸累積，但操作性不強。筆者認(rèn)為，銅離子（Gu²⁺）的添加是目前為止降低乳酸累積的方法，除去Gu²⁺抑制乳酸累積的作用，許多研究中都提到Gu²⁺對細(xì)胞的生長具有促進作用。Luo等就研究了不同濃度的Gu²⁺對細(xì)胞生長、乳酸累積和蛋白產(chǎn)量的影響，如圖1所示，培養(yǎng)至第五天時，細(xì)胞表現(xiàn)開始出現(xiàn)差異，高濃度Gu²⁺實驗組細(xì)胞密度繼續(xù)增加、乳酸開始消耗；而低濃度Gu²⁺實驗組的乳酸一直在累積，開始顯現(xiàn)出對細(xì)胞的抑制作用；從蛋白產(chǎn)量看，高濃度Gu²⁺實驗組的蛋白濃度要高些，可知Gu²⁺的添加可促進細(xì)胞對乳酸的消耗及細(xì)胞生長。值得注意的是，Gu²⁺的添加會影響到單抗的質(zhì)量，如增加堿性峰的比例、降低高甘露糖型水平等。

圖1 Gu2+濃度對細(xì)胞生長、乳酸累積及蛋白產(chǎn)量的影響

圖1 Gu²⁺濃度對細(xì)胞生長、乳酸累積及蛋白產(chǎn)量的影響

（圖片來源于參考文獻1）

銨

作為細(xì)胞培養(yǎng)過程中的另一代謝副產(chǎn)物，銨受到的關(guān)注遠(yuǎn)沒有乳酸多，這是因為目前使用的CHO細(xì)胞中多采用的谷氨酰胺合成酶（GS）擴增系統(tǒng)，而GS細(xì)胞一般都可以利用銨來合成谷氨酰胺，因此關(guān)于降低銨累積對細(xì)胞**作用的研究較少。然而并不是所有的細(xì)胞系都是GS系統(tǒng)，還有二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolatereductase，DHFR）篩選系統(tǒng)等，因此對銨的**機理、降低累積的認(rèn)識還是很有必要的，可以幫助我們更好的理解細(xì)胞培養(yǎng)過程。

體系中的銨主要來自于谷氨酰胺等的代謝降解和自發(fā)降解，其中自發(fā)降解只占很少一部分，大部分的銨都來自氨基酸如谷氨酰胺的代謝降解。正常情況下，培養(yǎng)體系中、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和線粒體的內(nèi)銨（NH4⁺）和氨（NH3）是處于一種動態(tài)平衡下的，一定的pH時兩者維持一定的濃度，同樣兩者的平衡也是維持細(xì)胞胞內(nèi)pH穩(wěn)定的重要條件。而當(dāng)其中之一，如NH4+的濃度超出正常范圍時，平衡被打破，進而引起胞內(nèi)pH的變化，影響細(xì)胞代謝相關(guān)酶的活性，不利于細(xì)胞的正常生長與代謝。還有學(xué)者認(rèn)為，由于銨本身就參與部分酶促反應(yīng)，如谷氨酸和銨合成谷氨酰胺的反應(yīng)、谷氨酸的進一步降解等，銨濃度的改變也會對此類代謝產(chǎn)生不可預(yù)估的影響。

由此可知，銨的累積會導(dǎo)致胞內(nèi)pH失衡及酶活降低，進而影響細(xì)胞表現(xiàn)。此外，銨的累積還會對蛋白質(zhì)量造成影響，主要表現(xiàn)在降低糖鏈末端的唾液酸化水平。高濃度銨水平下，α(2,3)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和GMP-唾液酸轉(zhuǎn)運蛋白水平都有一定降低，這不僅會導(dǎo)致胞液中唾液酸向高爾基體的轉(zhuǎn)動量降低，還會影響糖鏈上的唾液酸連接，最終降低蛋白的唾液酸化。

根據(jù)銨的來源來降低是重要的策略，如采用不易自發(fā)降解的谷氨酰胺衍生物代替谷氨酰胺，以及使用谷氨酸代替谷氨酰胺添加到培養(yǎng)基中都是可以的方法。還有學(xué)者以氨基酸為出發(fā)點，研究了不同氨基酸對降低銨對細(xì)胞**的影響，最終得出蘇氨酸（threonine）、脯氨酸（proline）和甘氨酸（glycine）可以抑制高濃度銨對細(xì)胞的**。如圖2所示，同樣高濃度NH₄Cl的情況下，添加以上三種氨基酸實驗組的細(xì)胞要高些。基因手段也可以降低銨的累積，例如刪除乳酸脫氫酶（LDH）基因，有學(xué)者進行相關(guān)實驗時發(fā)現(xiàn)LDH基因刪除的實驗組，其乳酸及銨累積均有一定的降低。另外，合理的谷氨酰胺和葡萄糖補料策略也是控制銨濃度的方法之一。

圖2 氨基酸對高濃度銨離子添加培養(yǎng)基中細(xì)胞密度的影響