與張鋒同！女神也上Science：CRISPR變身診斷工具，可檢測(cè)HPV

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來源：轉(zhuǎn)載

2018-02-28

俗話說，一時(shí)瑜亮。在CRISPR領(lǐng)域，Broad研究所的張鋒與加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer Doudna是眾所周知的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手。2月15日，就在張鋒團(tuán)隊(duì)發(fā)布新成果的同時(shí)， “女神”也“出手了”！

早在2012年8月，Doudna教授與現(xiàn)任Max Planck研究所感染生物學(xué)部主任的Emmanuelle Charpentier在Science雜志上發(fā)表了一篇題為“A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity”的重要成果，首次揭示了CRISPR/Cas這一天然免疫系統(tǒng)的基因組編輯功能。

In the genome editing technology known as CRISPR-Cas9, RNA (blue) guides the protein Cas9 (large bumpy structure) to a target site in DNA (red). Cas9 unwinds the DNA double helix and acts as molecular scissors, snipping both strands of DNA.

之后，以CRISPR-Cas9為代表的新型基因編輯技術(shù)迅速風(fēng)靡科研圈，革新了生物醫(yī)學(xué)研究，加速了疾病成因的探索，并引發(fā)了許多潛在的新療法。與此同時(shí)，CRISPR家族也不斷擴(kuò)大，很多“新成員”浮出水面，其中就包括了CRISPR-Cas12a。

關(guān)鍵酶——Cas12a

與大家熟知的Cas9酶類似，Cas12a可用于切割目標(biāo)DNA。該蛋白最初被稱為Cpf1，于2015年由張鋒團(tuán)隊(duì)在一篇題為“Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”的Cell論文中首次提出。

學(xué)界認(rèn)為，Cas12a是基因切割工具箱的一個(gè)重要補(bǔ)充，能夠在Cas9不能作用的位置切割雙鏈DNA；同時(shí)，由于Cas12a切割DNA后留下的是不規(guī)則的邊緣（ragged edges），這可能使在切割處插入一個(gè)新的基因更容易。

不過，Doudna教授的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cas12a結(jié)合并切割了目標(biāo)雙鏈DNA時(shí)，它會(huì)在試管中出人意料地對(duì)所有的單鏈DNA發(fā)動(dòng)任意切割。

值得慶幸的是，由于細(xì)胞中大部分DNA是以雙鏈螺旋的形式存在，因此，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于Cas12a的基因編輯功能并不一定是個(gè)問題。相反，Cas12a對(duì)單鏈DNA的這種“任意切割”還給科學(xué)家們帶來了驚喜：允許他們將一個(gè)單鏈“報(bào)告”分子與Cas12a蛋白進(jìn)行聯(lián)用，當(dāng)Cas12a發(fā)現(xiàn)它的目標(biāo)后，報(bào)告分子會(huì)產(chǎn)生一種清晰的熒光信號(hào)。

圖片來源：Science（DOI: 10.1126/science.aar6245）

快速、簡(jiǎn)便的診斷系統(tǒng)——DETECTR

基于這一思路，Doudna教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種被稱為“DETECTR”（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）的診斷系統(tǒng)，可用于對(duì)臨床樣本中的少量DNA進(jìn)行快速、簡(jiǎn)便地即時(shí)檢測(cè)。相關(guān)成果以“CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity”為題發(fā)表在Science雜志上。

Infographic by the Howard Hughes Medical Institute

具體來說，DETECTR是在一個(gè)單一反應(yīng)中添加所有試劑，包括CRISPR-Cas12a和它的向?qū)NA、熒光報(bào)告分子以及一種叫做RPA（recombinase polymerase amplification，類似于PCR）的等溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)。當(dāng)加熱到體溫時(shí)，RPA會(huì)快速增加目標(biāo)DNA的拷貝數(shù)，使Cas12a更容易找到并切割它，然后任意切割附近單鏈DNA，從而讓報(bào)告分子發(fā)出熒光（具體發(fā)光機(jī)制見上圖）。

基于CRISPR-Cas12a的DETECTR系統(tǒng)能夠分析細(xì)胞、血液、唾液、尿液和糞便，以檢測(cè)基因突變、癌癥和抗生素耐藥性，以及診斷細(xì)菌和病毒感染。

研究中，科學(xué)家們利用包含人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的患者樣本對(duì)DETECTR進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果顯示，利用DETECTR，他們能夠在感染多種不同HPV類型的樣本中準(zhǔn)確測(cè)定出高風(fēng)險(xiǎn)的HPV 類型：HPV16和HPV18。

論文的共同第一作者Janice S. Chen認(rèn)為，Cas12a可作為一種強(qiáng)有力的工具，用于從各種各樣的來源中檢測(cè)DNA。DETECTR這項(xiàng)技術(shù)可能適用于任何基于DNA檢測(cè)的即時(shí)診斷情況，包括癌癥和傳染病。

再次驗(yàn)證CRISPR酶的檢測(cè)功能

事實(shí)上，Cas12a與CRISPR酶家族的另一個(gè)蛋白Cas13a活性類似。也正是利用后者，張鋒團(tuán)隊(duì)在同日發(fā)表在Science論文中提出了升級(jí)版的診斷工具SHERLOCK。詳細(xì)閱讀《張鋒最新Science！CRISPR新功能升級(jí)，可用于腫瘤DNA等多種核酸檢測(cè)》一文。

Cas13a于2016年6月由張鋒團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)；3個(gè)月后，女神研究組就證實(shí)了該酶的“collateral cleavage”活性（Cas13a在切割了它的意向RNA目標(biāo)后依然能夠保持“活躍”，繼續(xù)爆發(fā)性式地切割其他非目標(biāo)RNA）可用于RNA檢測(cè)。不多久（2017年4月），張鋒團(tuán)隊(duì)也開發(fā)出了基于Cas13a的初級(jí)版SHERLOCK。兩大陣營(yíng)在這一研究方向的競(jìng)爭(zhēng)可謂非常激烈。