我們身體中每個(gè)細(xì)胞的基因組DNA每天都會(huì)面臨成千上萬(wàn)次的損傷。所幸的是，細(xì)胞中有一套能夠修復(fù)各種類型損傷的機(jī)器來(lái)保證基因組的完整性（genome integrity）。修復(fù)DNA損傷的機(jī)器在從酵母到人所有的真核生物中都是非常保守的，因此酵母作為模式生物被廣泛應(yīng)用于DNA修復(fù)（DNA repair）方面的研究。在所有類型的DNA損傷中，DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs）是最嚴(yán)重的。DNA雙鏈斷裂如果得不到正確的修復(fù)往往會(huì)引發(fā)癌癥。對(duì)DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制進(jìn)行研究不僅關(guān)系到人類健康，還有助于對(duì)一些基本的生物學(xué)問(wèn)題如基因組的突變、重組和進(jìn)化的理解。DNA雙鏈斷裂主要通過(guò)兩種途徑進(jìn)行修復(fù)：同源重組（homologous recombination, HR）和非同源末端連接（nonhomologous end-joining, NHEJ）。同源重組依賴于完整的同源序列進(jìn)行修復(fù)，因此保真性高。而非同源末端連接不依賴于模板，保真性差，修復(fù)產(chǎn)物通常帶有幾個(gè)堿基對(duì)的插入或缺失。

       之前，人們檢測(cè)非同源末端連接的修復(fù)產(chǎn)物，偶爾會(huì)看到一些長(zhǎng)片段DNA序列——來(lái)自可移動(dòng)的遺傳元件如轉(zhuǎn)座子、細(xì)胞核基因組其他區(qū)域以及線粒體DNA——會(huì)插入到DNA雙鏈斷裂部位從而影響基因組的完整性。長(zhǎng)片段DNA的插入在癌癥基因組里普遍存在【1】。有意思的是，最近在產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞中V（D）J位點(diǎn)也發(fā)現(xiàn)了來(lái)自基因組其他位點(diǎn)的長(zhǎng)片段DNA插入。插入長(zhǎng)片段DNA的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體能夠特異性結(jié)合瘧原蟲(chóng)抗原。因此，這種長(zhǎng)片段DNA的插入增加了抗體的多樣性【2】。另外，最近在CRISPR/Cas9的基因編輯產(chǎn)物中也發(fā)現(xiàn)有長(zhǎng)片段DNA插入。但是，人們對(duì)于長(zhǎng)片段DNA插入的機(jī)理還不明確。這種長(zhǎng)片段DNA在細(xì)胞里是如何產(chǎn)生的？細(xì)胞又是如何抑制長(zhǎng)片段DNA插入的呢？

       近日，來(lái)自美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院的Grzegorz Ira實(shí)驗(yàn)室、休斯頓衛(wèi)理公會(huì)醫(yī)院Kaifu Chen實(shí)驗(yàn)室和安德森癌癥中心的Guang Peng博士等（第一作者為于洋博士，2013年畢業(yè)于北京生命科學(xué)研究所杜立林實(shí)驗(yàn)室，另外兩名并列第一作者是Nhung Pham和Bo Xia，共同通訊作者為Grzegorz Ira博士和Kaifu Chen博士）在Nature雜志上發(fā)表了題為Dna2 Nuclease Deficiency Results in Large and Complex DNA Insertions at Chromosomal Breaks的研究論文，報(bào)導(dǎo)了酵母核酸酶Dna2缺失突變體中DNA雙鏈斷裂部位具有高頻率的長(zhǎng)片段DNA序列插入。這是目前為止報(bào)導(dǎo)的第一個(gè)有這樣表型的真核生物突變體。

       Dna2的缺失突變體中，插入到DNA雙鏈斷裂部位的長(zhǎng)片段DNA序列長(zhǎng)度大約100-1500 bp。大部分插入都只有一個(gè)供體片段，另外一些是2-4個(gè)來(lái)自于基因組不同位點(diǎn)的供體片段連在一起進(jìn)行插入。通過(guò)分析這些插入序列，發(fā)現(xiàn)供體DNA來(lái)自于逆轉(zhuǎn)座子、核糖體DNA以及整個(gè)基因組的其他區(qū)域。這些供體DNA顯著地在基因組脆性位點(diǎn)聚集（如復(fù)制起點(diǎn)、R-loop、中心粒、端粒以及復(fù)制叉受阻區(qū)域）。DNA雙鏈斷裂部位長(zhǎng)片段DNA插入主要通過(guò)非同源末端連接而不是通過(guò)同源重組介導(dǎo)。

       作者還發(fā)現(xiàn)，在Dna2的缺失突變體中，插入序列的供體DNA并沒(méi)有從原來(lái)位點(diǎn)上刪除，表明這種插入是一種復(fù)制-粘貼形式的重復(fù)（duplication），造成整個(gè)基因組的任何DNA片段都變得可以移動(dòng)。因?yàn)槭侵貜?fù)并且供體DNA在脆性位點(diǎn)聚集，提示供體DNA源自過(guò)度復(fù)制（over-replication）。核酸酶Dna2通過(guò)兩種方式抑制DNA的過(guò)度復(fù)制：第一種方式是在滯后鏈合成過(guò)程中，去除岡崎片段上5’端的flap單鏈DNA；第二種方式是阻止復(fù)制叉的倒轉(zhuǎn)（replication fork reversal）和/或降解已經(jīng)倒轉(zhuǎn)的復(fù)制叉【3-6】。5’端的flap單鏈長(zhǎng)DNA可能是供體DNA的一個(gè)來(lái)源，因?yàn)榍贸齈if1和Pol32這兩個(gè)復(fù)制過(guò)程中起取代合成（displacement synthesis）作用的蛋白質(zhì)能夠減低長(zhǎng)片段DNA插入頻率并且降低了供體DNA的長(zhǎng)度。

       由于供體DNA在復(fù)制叉前行容易受阻的脆性位點(diǎn)聚集，表明倒轉(zhuǎn)的復(fù)制叉也可能是供體DNA的來(lái)源。在Dna2缺失情況下，原本通過(guò)Dna2加工處理的DNA結(jié)構(gòu)可以通過(guò)其他的替代性核酸酶進(jìn)行加工處理從而從復(fù)制叉上脫落。Mus81和Yen1是兩個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)特異性核酸酶。在Dna2突變體中再引入Mus81和Yen1的突變能夠改變長(zhǎng)片段DNA插入頻率。

       作者提出一個(gè)模型來(lái)解釋Dna2缺失突變體中在DNA雙鏈斷裂部位長(zhǎng)片段DNA插入：5’端的flap單鏈長(zhǎng)DNA和倒轉(zhuǎn)的復(fù)制叉可以通過(guò)取代合成以及替代性核酸酶處理后從復(fù)制叉上脫離從而游離于染色體之外；這些游離的單鏈DNA和雙鏈DNA可以被雙鏈斷裂的DNA末端捕獲從而作為底物通過(guò)非同源末端連接修復(fù)途徑被插入到斷裂部位（下圖）。與這個(gè)模型相符的是，作者發(fā)現(xiàn)相比野生型而言，Dna2缺失突變體具有更多游離的長(zhǎng)片段DNA。并且發(fā)現(xiàn)外源導(dǎo)入的單鏈DNA和雙鏈DNA不僅在Dna2缺失突變體中而且也可以在野生型細(xì)胞中被插入到DNA雙鏈斷裂部位，表明只要長(zhǎng)片段單鏈DNA或雙鏈DNA存在于細(xì)胞中就可以被斷裂的DNA雙鏈末端捕獲而不必需要缺失Dna2。

       Dna2缺失的細(xì)胞中大片段插入的模型

       這項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)的抑制基因組不穩(wěn)定性（genome instability）的新機(jī)制為癌癥基因組和V（D）J位點(diǎn)中類似大小的長(zhǎng)片段DNA插入提供了一個(gè)可能的解釋。游離于染色體外的長(zhǎng)片段DNA被斷裂的DNA雙鏈末端捕獲會(huì)對(duì)基因組的完整性形成威脅，但是也可能在進(jìn)化過(guò)程中能夠促進(jìn)基因和其他遺傳元件的重復(fù)以及物種間的基因水平轉(zhuǎn)移。長(zhǎng)片段DNA插入有可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，因此抑制游離的長(zhǎng)片段DNA的產(chǎn)生或者促進(jìn)它們的降解可能是一個(gè)潛在的防治腫瘤的方案。

       參考文獻(xiàn)

       1. Li, Y. et al. Patterns of structural variation in human cancer. BioRxiv doi: https://doi.org/10.1101/181339 (2017).

       2. Pieper, K. et al. Public antibodies to malaria antigens generated by two LAIR1 insertion modalities. Nature 548, 597-601, doi:10.1038/nature23670 (2017).

       3. Budd, M. E., Reis, C. C., Smith, S., Myung, K. & Campbell, J. L. Evidence suggesting that Pif1 helicase functions in DNA replication with the Dna2 helicase/nuclease and DNA polymerase delta. Mol Cell Biol 26, 2490-2500 (2006).

       4. Hu, J. et al. The intra-S phase checkpoint targets Dna2 to prevent stalled replication forks from reversing. Cell 149, 1221-1232, doi:10.1016/j.cell.2012.04.030 (2012).

       5. Thangavel, S. et al. DNA2 drives processing and restart of reversed replication forks in human cells. J Cell Biol 208, 545-562, doi:10.1083/jcb.201406100 (2015).

       6. Liu, B., Hu, J., Wang, J. & Kong, D. Direct Visualization of RNA-DNA Primer Removal from Okazaki Fragments Provides Support for Flap Cleavage and Exonucleolytic Pathways in Eukaryotic Cells. J Biol Chem 292, 4777-4788, doi:10.1074/jbc.M116.758599 (2017).