嵌合抗原受體（CAR）是一類(lèi)工程化的細(xì)胞表面受體，一般表達(dá)在T細(xì)胞上，介導(dǎo)工程化T細(xì)胞針對(duì)特定靶點(diǎn)腫瘤細(xì)胞的殺傷。其中針對(duì)CD19（一種B細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白）的兩款CAR-T細(xì)胞療法Kymriah（諾華）和Yescarta（吉利德）已經(jīng)于2017年獲得了FDA的批準(zhǔn)，開(kāi)創(chuàng)了CAR-T細(xì)胞療法的元年。
縱觀CAR-T的發(fā)展史，第一代CAR-T只有CD3ζ鏈（ITAM，Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs）；第二代CAR-T添加了CD28或4-1BB等共刺激結(jié)構(gòu)域（CM1），比如Kymriah和Yescarta；第三代CAR-T同時(shí)添加了CD28和4-1BB等兩個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域（CM1和CM2）；第四代CAR-T在第二代的基礎(chǔ)上添加了共表達(dá)的細(xì)胞因子，比如IL-12等；第五代CAR-T同樣基于第二代，添加了激活其它信號(hào)通路的共刺激結(jié)構(gòu)域，比如IL2-2Rβ胞內(nèi)結(jié)合SAAT3/5的結(jié)構(gòu)域。這一代又一代各種不同的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，賦予了CAR-T細(xì)胞療法無(wú)限的生機(jī)和未來(lái)（圖1）。
圖1：CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)發(fā)展歷程
上述5代不同設(shè)計(jì)的CAR-T，雖然都是工程化組合不同信號(hào)分子結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，但仍局限在直接利用原始結(jié)構(gòu)域的范疇內(nèi)。比如使用CD3ζ鏈信號(hào)傳導(dǎo)基序的天然序列（包含3個(gè)ITAM），或者使用CD28、4-1BB的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的原始序列，對(duì)結(jié)構(gòu)域本身并未做任何工程化改造。特別是CAR設(shè)計(jì)中最重要的CD3ζ結(jié)構(gòu)域，幾乎全都是包含3個(gè)ITAM結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)全長(zhǎng)序列。然而近日紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心的Michel Sadelain及其團(tuán)隊(duì)在Nature Medicine上發(fā)表的一篇重磅研究指出使用CD3ζ鏈中的1個(gè)ITAM結(jié)構(gòu)域的而不是全長(zhǎng)，可以獲得更強(qiáng)的腫瘤抑制活性，該研究或?qū)㈤_(kāi)啟未來(lái)CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的全新思路。
Michel Sadelain及其團(tuán)隊(duì)針對(duì)使用CD28-CD3ζ的CAR-T細(xì)胞較容易出現(xiàn)T細(xì)胞耗竭的現(xiàn)象，提出假設(shè)認(rèn)為這可能是由于CD3ζ包含的3個(gè)ITAM結(jié)構(gòu)域過(guò)度激活T細(xì)胞導(dǎo)致的。因此他們基于CD19-CD28-CD3ζ的經(jīng)典CAR-T結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了3種突變型CD3ζ結(jié)構(gòu)域，分別突變失活了1個(gè)或2個(gè)ITAM結(jié)構(gòu)域（圖2）。結(jié)果在小鼠腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)只有ITAM-1結(jié)構(gòu)域有活性的CAR-T細(xì)胞（1XX）體內(nèi)抗腫瘤活性反而更強(qiáng)，并且具有更長(zhǎng)的持久力；而保留ITAM-3結(jié)構(gòu)域活性的CAR-T細(xì)胞（XX3）抗腫瘤活性最差（圖3）。
圖2：不同CD3ζ突變的CD19-CD28-CD3ζ結(jié)構(gòu)，通過(guò)點(diǎn)突變技術(shù)廢除了ITAM結(jié)構(gòu)域的活性
圖3：小鼠腫瘤模型評(píng)價(jià)CAR-T細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞的能力
基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究者懷疑是不是由于ITAM-3結(jié)構(gòu)域本身傳導(dǎo)信號(hào)的能力較弱才導(dǎo)致只保留ITAM-3結(jié)構(gòu)域活性的CAR-T細(xì)胞效果最差呢？因此他們?cè)O(shè)計(jì)了只含有ITAM-1或ITAM-3的CAR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們都可以產(chǎn)生相當(dāng)?shù)摹⒈冉?jīng)典的CAR-T更強(qiáng)的抑制腫瘤的活性（圖4）。這些結(jié)果說(shuō)明在CD19-CD28-CD3ζ結(jié)構(gòu)中，ITAM的數(shù)量和所處的位置對(duì)CAR-T細(xì)胞抑制腫瘤的能力具有重要的影響，越靠近跨膜區(qū)的ITAM傳導(dǎo)信號(hào)的能力越強(qiáng)。
圖4：截?cái)郈D3ζ的CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和小鼠體內(nèi)腫瘤抑制能力的評(píng)價(jià)
在TCR信號(hào)傳導(dǎo)中，CD3ζ的激活基序ITAM發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，當(dāng)TCR-CD3與MHC-peptide結(jié)合后，一個(gè)叫做Lck的酪氨酸激酶磷酸化CD3ζ的ITAM結(jié)構(gòu)域，磷酸化的ITAM招募并結(jié)合ZAP-70蛋白，招募的ZAP-70同樣被Lck磷酸化并和Lck一起磷酸化其它的蛋白從而傳導(dǎo)T細(xì)胞激活信號(hào)（圖5）。
圖5：TCR-CD3信號(hào)通路主要相關(guān)蛋白
在T細(xì)胞的天然激活過(guò)程中，CD3ζ的3個(gè)ITAM都是不可或缺的，但是為什么在CD19-CD28-CD3ζ結(jié)構(gòu)的CAR-T細(xì)胞中只有一個(gè)ITAM反而會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的腫瘤抑制活性呢？ Michel Sadelain等通過(guò)全基因組規(guī)模的轉(zhuǎn)錄圖譜分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)典結(jié)構(gòu)的CAR-T細(xì)胞更接近效應(yīng)T細(xì)胞，1XX結(jié)構(gòu)的CAR-T細(xì)胞更接近于記憶T細(xì)胞，而腫瘤抑制活性最差的XX3結(jié)構(gòu)CAR-T細(xì)胞更接近于初始T細(xì)胞（圖6）。所以在體內(nèi)，同時(shí)具備一定效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞能力的1XX結(jié)構(gòu)CAR-T細(xì)胞具有更持久的腫瘤抑制活性也就不奇怪了。
圖6：3種CAR-T細(xì)胞表型分析
最后筆者認(rèn)為，在CD28作為共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR設(shè)計(jì)中，減少I(mǎi)TAM明顯具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)；然而在基于4-1BB作為共刺激結(jié)構(gòu)域的設(shè)計(jì)中，減少還是增加ITAM更有效果還需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但最終的目標(biāo)都是找到一個(gè)最合適的T細(xì)胞激活程度，過(guò)多或過(guò)少都不能發(fā)揮最強(qiáng)的腫瘤抑制活性，基于該設(shè)計(jì)的臨床實(shí)驗(yàn)也在進(jìn)行中，我們期待將來(lái)會(huì)有不錯(cuò)的數(shù)據(jù)公布。
參考文獻(xiàn)：
1. Calibration of CAR activation potential directs alternative T cell fates and therapeutic potency.
2. Selected signalling proteins recruited to the T cell receptor-CD3 complex.
3. Teaching an old dog new tricks: next-generation CAR T cells.
筆者簡(jiǎn)介：Harry，分子生物學(xué)方向碩士，腫瘤免疫療法從業(yè)人員，致力于為更好的腫瘤免疫療法貢獻(xiàn)一份力量。
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