新藥研發(fā)集運(yùn)氣與智力于一體，它涉及偶然發(fā)現(xiàn)、大膽假設(shè)、小心求證、產(chǎn)品開發(fā)及療效考察等多個步驟。
伏立諾他（vorinostat）是一種組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC）抑制劑，通過干擾去乙酰化酶的活性達(dá)到治療目的。2006年10月6日美國FDA批準(zhǔn)伏立諾他上市用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（cutaneous T-cell lymphoma, CTCL）。
伏立諾他的研發(fā)始于科研人員偶然發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）具有誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的作用?？蒲腥藛T從DMSO這個最簡單的分子開始，通過大膽假設(shè)和科學(xué)求證，最終成功研發(fā)出了第一個HDAC抑制劑。
苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)
Friend團(tuán)隊在研究小鼠紅白血病細(xì)胞（murine erythroleukemia cell, MELC）轉(zhuǎn)染的抑制作用時發(fā)現(xiàn)，在含有低濃度DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液中約有三分之二的癌細(xì)胞的顏色變成紅色。于是他們猜想DMSO可能刺激MELC分化，繼而提高了血紅蛋白的濃度，減少了細(xì)胞的惡化，故癌細(xì)胞顏色變紅。因此，科研人員以DMSO為起始物進(jìn)行伏立諾他的研發(fā)。
先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)
隨后Breslow課題組對DMSO進(jìn)行了相應(yīng)的構(gòu)效關(guān)系研究，并從DMSO擴(kuò)展到與其類似的極性化合物，研究發(fā)現(xiàn)以下化合物1-12均具有DMSO誘導(dǎo)MELC分化的類似作用。
科學(xué)家假設(shè)，細(xì)胞在合成DNA時，這類極性化合物可能改變了DNA或DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的構(gòu)象，從而致使細(xì)胞在傳染及分化過程中發(fā)生改變。
為了進(jìn)一步提高化合物的誘導(dǎo)活性，研究者以化合物5為起始物，設(shè)計并合成了一系列化合物5的二聚化物，欲通過增加化合物的極性基團(tuán)以增加其與未知標(biāo)靶的結(jié)合能力。活性測定結(jié)果顯示，最簡單的雙酰基乙二胺13的活性并未強(qiáng)于化合物5，但是當(dāng)二聚物之間的鏈長增加到5-8時，其活性則顯著增強(qiáng)，且在低濃度下亦有較高的誘導(dǎo)活性。然而當(dāng)鏈長為7-8時，其有明顯的細(xì)胞毒活性，而當(dāng)鏈長為5-6時既有較高的誘導(dǎo)活性且不產(chǎn)生細(xì)胞毒活性，且六亞甲基雙乙酰胺14（hexamethylene bisacetamide, HMBA）有最高的誘導(dǎo)活性。后期篩選發(fā)現(xiàn)，化合物14為活性和**之間有顯著區(qū)分的優(yōu)選分子，為第一個里程碑式的化合物。
雜合的雙功能基的異羥肟酸
雖然對雙酰胺類化合物誘導(dǎo)細(xì)胞分化的作用靶標(biāo)仍不明確，但是前期研究已經(jīng)證明，兩個酰胺基團(tuán)是化合物的優(yōu)化結(jié)構(gòu)。所以研究者進(jìn)一步猜測，這兩個酰胺基團(tuán)可能通過與金屬離子螯合或形成氫鍵而起藥理活性的作用，故研究者利用異羥肟酸片段來替換酰胺基以進(jìn)一步增強(qiáng)化合物與金屬的螯合力或增加氫鍵結(jié)合的機(jī)會，因此合成了一系列雙異羥肟酸化合物?？疾炝巳嵝赃B接基、剛?cè)岵?jì)的連接基以及剛性連接基對活性的影響。
構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)
(1) 用異羥肟酸片段來替換酰胺基后，衍生物的活性顯著增強(qiáng)，其中辛二酸雙異羥肟酸16的活性最高，約為HMBA的100倍以上；
(2) 連接基庚二酸和壬二酸的雙異羥肟酸（分別為15和17）的活性較化合物16低，且將連接基縮短后活性更低；
(3) 在?；?alpha;位引入甲基（如化合物18和19）后活性消失，這可能與位阻有關(guān)；
(4) 對甲苯二異羥肟酸21的活性與化合物16的活性相當(dāng)，而間苯二異羥肟酸22則無活性，單個或三個異羥肟酸亦無活性；
(5) 在化合物21的基礎(chǔ)上各嵌入一個亞甲基得到的化合物23則活性消失，但各嵌入兩個亞甲基后的化合物24活性恢復(fù)，但是若引入雙鍵則化合物25和26活性顯著增強(qiáng)。
微小的結(jié)構(gòu)變動引起活性的劇烈變化，提示化合物與靶標(biāo)結(jié)合的精準(zhǔn)性與復(fù)雜性。研究者進(jìn)一步篩選了活性較強(qiáng)的衍生物對HL-60和HT-29細(xì)胞的誘導(dǎo)分化活性，結(jié)果表明，化合物16的活性最好。
伏立諾他的發(fā)現(xiàn)及批準(zhǔn)上市
由于羥肟酸是強(qiáng)效的金屬螯合基團(tuán)，但是同時存在兩個強(qiáng)效的螯合基團(tuán)可能非必需，因此研究者用一個極性基團(tuán)將其置換，合成了600多個化合物。但在結(jié)構(gòu)變換過程中，考慮若用非極性疏水基團(tuán)替換羥肟酸則可利用酶或受體活性部位的疏水腔或裂隙發(fā)生疏水?疏水相互作用以增強(qiáng)活性，從而得到了活性更高的衍生物27。后期活性測定發(fā)現(xiàn)，衍生物27對HDAC1 和 HDAC3 的抑制活性IC50達(dá)到 1-5 nmol·L-1。體外實(shí)驗(yàn)表明衍生物27對多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗增殖和促凋亡的作用，并可抑制血管的生成，且與其他的抗腫瘤藥物表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用。藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，衍生物27的藥物半衰期t1/2為2小時，且與血漿蛋白的結(jié)合率高達(dá)71%。2007年衍生物27被美國FDA批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，伏立諾他就此誕生。
伏立諾他的問世可以說創(chuàng)造了奇跡，它是在靶標(biāo)及作用機(jī)制均不清楚的情況下，完全依靠最傳統(tǒng)的構(gòu)效關(guān)系研究，經(jīng)過一步步的摸索最終上市。
參考文獻(xiàn)
1.Charlotte Friend, William Scher, J. G. Holland, etc. Hemo-globin synthesis inmurine virus-induced leukemic cells in vitro: stimulation of erythroid differentiation by dimethyl sulfoxide. J. PNAS, 1971, 378-382.
2.Paul A. Marks,Richard A. Rifkind,Ronald Breslow, etc. Novel potent inducers of terminal differentiation and methods of use thereof. P. United States, 07/522558, 1992.
3.Richard Campbell, Eric Sanchez, Jeffrey Steinberg, etc. The potent histone deacetylase inhibitor vorinostat, in combination with melphalan, markedly enhances the anti-myeloma effects of chemotherapy in vitro and in vivo. J. Cancer Research, 2008, 12-16.
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