01

       Levofloxacin的研發(fā)歷史

       左氧氟沙星（Levofloxacin）屬于第三代喹諾酮類藥物。喹諾酮類（quinolones）藥物是一類人工合成的抗菌藥，這類藥的共同特點有：

       1、抗菌譜廣、抗菌活性強；

       2、口服吸收良好；

       3、體內分布廣、血漿半衰期較長；

       4、不良反應相對較少。

       喹諾酮類藥物來源于意外的發(fā)現——世界各國在開展合成抗瘧疾藥物的研究過程中產生的大量副產品。1946年，美國斯特林· 懷特研究院的有機化學家勒謝（George Y. Lesher, 1926-1990）博士在進行一項實驗，試圖合成抗瘧疾藥物氯喹。在對合成過程中的副產品進行常規(guī)篩選時發(fā)現了一個副產物——7-氯-1-乙基-1，4-二氫-4-氧代-3-喹啉羖酸，它在體外對若干革蘭氏陰性菌具有弱的活性。這個發(fā)現促進了設計和合成新類似物的研究。

       圖1. 氯喹結構式

       圖2. 7-氯-1-乙基-1，4-二氫-4-氧代-3-喹啉羖酸結構式

       1962年，勒謝博士研制出了萘啶酸，并報道其可作為新型抗菌藥物。這是第一個上市的喹諾酮類藥物，也是后來形成的喹諾酮家族的祖先。

       圖3.勒謝博士及刊發(fā)文章

       多年來，國內外對喹諾酮類藥物的結構進行不斷地修飾，陸續(xù)開發(fā)出了多種新藥物并投入臨床使用。該類藥物的抗菌譜伴隨著研究的深入而不斷拓寬，從單一抗革蘭陰性菌的窄菌譜，逐漸發(fā)展成為抗革蘭陽性菌、厭氧菌、分枝桿菌、軍團菌、支原體和衣原體的廣譜抗菌藥。到目前喹諾酮類藥物已經經歷了4代發(fā)展。

       圖4. 喹諾酮類結構式

       第1代喹諾酮類藥物：以萘啶酸為代表，抗菌譜窄且藥效較弱，僅對大腸桿菌、痢疾桿菌、克雷伯桿菌等病原體有效。主要用于治療革蘭陰性桿菌所致的尿路感染，但易形成耐藥性，現已基本被淘汰。

       圖5. 萘啶酸結構式

       第2代喹諾酮類藥物：包括批哌酸、西諾沙星等，其在抗菌譜較第1代有所擴大，雖然仍然對革蘭氏陽性菌藥效不佳，但其副作用較少，可用于治療腸道和尿路感染。但是該其血漿濃度不高，且隨著耐藥性發(fā)展迅速，應用也日趨減少。

       圖6. 第二代喹諾酮類藥物結構式

       第3代喹諾酮類藥物：主要有諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、培氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星等。第3代喹諾酮類藥物也稱氟喹諾酮類藥物，主要結構特征是在喹諾酮的6位引入氟原子，使其抗菌譜進一步擴大，對革蘭氏陰性菌和陽性菌及支原體、衣原體、軍團菌及分支桿菌都有抑制作用。因其效果好、抗菌譜廣、副作用小等特點，目前在臨床中的應用非常廣泛，用于泌尿生殖系統(tǒng)、胃腸道疾病，以及呼吸道、皮膚組織的革蘭陰性細菌感染的治療。

       圖7. 第三代喹諾酮類藥物結構式

       第4代喹諾酮類藥物：也稱新氟喹諾酮類藥物，主要包括格帕沙星、克林沙星、加替沙星、莫西沙星等?？咕V是目前為止最 大的，其結構特點為繼續(xù)保留母核6位F，并在5或8位引入氨基或甲基及甲氧基衍生物。除了保持第3代抗菌譜廣、抗菌活性強、組織滲透性好等優(yōu)點外，新氟喹諾酮類藥物的抗菌譜進一步擴大，且對革蘭陽性菌和厭氧菌的活性作用增強。

       圖8. 第四代喹諾酮類藥物結構式

       02

       Levofloxacin的合成分析

       左氧氟沙星是一種十分重要的藥物分子，因而它的合成自然也是受到科學家的廣泛關注，其中并環(huán)骨架的構建是較為容易的工作，因而如何高效構建左氧氟沙星中的手性中心成為科學家致力于解決的問題。

       當前主要的合成思路有兩種，即化學拆分和立體選擇性合成。前者由外消旋的氧氟沙星或其前體經過物理或化學手段進行手性拆分，后者則是直接在反應中使用帶有手性的底物或手性試劑進行反應得到手性產物?；瘜W拆分包括用HPLC直接拆分外消旋的氧氟沙星（圖9）、拆分氧氟沙星的前體酯（圖10）等方法。立體選擇性合成的底物有多種選擇，其中使用較多的是三氟硝基苯和四氟苯甲酸。

       以三氟硝基苯為起始原料（圖11），通過多種方法得到光學活性的苯并噁嗪中間體后，再通過常用方法合成出產品。以四氟苯甲酸為起始原料（圖12），加入S-2-氨基丙醇，環(huán)合水解得到最終產物，該路線經歷8步反應，總收率為39.2%。

       圖9. 用HPLC直接拆分外消旋的氧氟沙星

       圖10. 拆分氧氟沙星的前體酯

       圖11. 以三氟硝基苯為起始原料的立體選擇性合成

       圖12. 以四氟苯甲酸為起始原料的立體選擇性合成，趙愛桔，2011

       化學拆分最多只有50%轉化為左氧氟沙星，而剩下的為活性很弱的右氧氟沙星，且目前尚無將右旋轉為左旋的報道，所以化學拆分無法擴大規(guī)模而工業(yè)化生產左氧氟沙星。三氟硝基苯屬于第一類危險品——爆炸 物質和物品，在使用、儲藏和運輸過程中都需要采取妥善措施。對于四氟苯甲酸為起始原料的合成路徑來說，合成中需要的四氟苯甲酸和S-2-氨基丙醇國內均有售，且工藝穩(wěn)定，收率較高，是一條比較完善的可投入工業(yè)化生產的合成路線。

       03

       Levofloxacin的作用機理

       關于左氧氟沙星的殺菌機制，籠統(tǒng)地說，左氧氟沙星是通過與拓撲異構酶-DNA單鏈復合物結合，阻止細菌的兩種拓撲異構酶（旋轉酶與拓撲異構酶Ⅳ）作用，從而抑制細菌DNA的復制，導致細菌生長增殖停滯，繼而死亡。

       拓撲異構酶通過催化DNA鏈的斷裂、旋轉和再連接，清除在聚合酶行進過程中產生的正超螺旋，使DNA復制能夠持續(xù)進行。

       旋轉酶（gyrase）屬于Ⅱ型拓撲異構酶，其催化的反應依賴于ATP，在ATP的存在下，一個DNA雙螺旋上的兩條鏈同時出現切口，隨后另一個DNA雙螺旋穿過切口，切口重新連接。

       圖13. 旋轉酶作用機制，來源：Journal of Antimicrobial Chemotherapy , 2003, 51, Suppl. S1, 29–35 Peter M. Hawkey

       喹諾酮類藥物的抗菌作用模型為：拓撲異構酶與雙鏈DNA結合，使其中一條鏈斷裂，引入一對交錯的單鏈缺口，酶與單鏈DNA斷裂的5’末端共價鍵連接形成酶-DNA復合物，DNA的堿基暴露，易與喹諾酮C-3、C-4位的羰基形成氫鍵連接，形成喹諾酮-DNA-酶三元復合物。一個切口形成的口袋可以結合4個喹諾酮分子。

       圖14. 左氧氟沙星結合機制 ，來源：Biochemistry,Vol. 28, No. 9, 1989 Shen et al.

       先后進入口袋的喹諾酮分子之間靠π-π堆疊的相互作用力結合，右旋的氧氟沙星的氮氧雜環(huán)上連的甲基在平伏鍵上而氫在直立鍵上，由于直立鍵需要向平面外伸展，所以處于平伏鍵的甲基由于體積比較大會阻礙堆疊作用，而左氧氟沙星的甲基在直立鍵向平面外伸展，分子間π-π堆積作用更強，從而與DNA結合更穩(wěn)定。同時有實驗表示，同樣的疏水口袋只能容納2個氧氟沙星而可以容納4個左氧氟沙星。

       圖15. 氧氟沙星與左氧氟沙星的分子對比，來源：Chem.Rev.2005,105,559-592, Lester A. Mitscher

       左氧氟沙星的耐藥機理主要有：

       1、Ⅱ型拓撲異構酶變異：使得藥物不能與酶-DNA復合物穩(wěn)定結合；

       2、細菌細胞膜通透性的改變：藥物進入細胞依賴膜孔蛋白，外膜蛋白與脂多糖變異均可使細菌攝取藥物減少而導致耐藥性；

       3、細菌的主動外排系統(tǒng)亢進：導致細菌內藥物濃度降低。

       04

       Levofloxacin的ADME

       ADME即指吸收、分布、代謝和排泄四部分。如何確保藥物分子易于吸收，可以良好的分布到作用地點，不產生有毒副作用代謝產物，并快速的排出體外，是藥物研發(fā)改進中困難的一環(huán)。身為明星藥物之一廣泛應用的左氧氟沙星，在ADME上具備有出色的表現。

       圖16. 口服左氧氟沙星后的藥代動力學參數，來源：Clin-Pharmacokinet , 19977, 32, 101–119, Fish, D.N.et al.

       1 吸收

       左氧氟沙星 50 至 500mg 單次和多次給藥后，其平均分布容積范圍為 1.09 至 1.26 L/kg（89 至 112L）。該數據表明藥物于組織中廣泛分散。在50mg-1000mg劑量的口服之后，到達血漿最 大濃度的時間集中于0.8-2.4h。并且服用藥物前是否進食對藥物的吸收分布并無影響。在臨床試驗中進行了24名健康實驗者（12男12女）的單次口服500mg劑量實驗，同時吃下高脂肪餐的實驗組tmax延長1h，cmax下降約14%（從5.93降至5.09mg/L），因此左氧氟沙星可以不考慮飲食情況而給藥。

       圖17. 左氧氟沙星口服或靜脈注射后血漿濃度變化，來源：Clin-Pharmacokinet , 19977, 32, 101–119, Fish, D.N.et al.

       如圖，左氧氟沙星口服和靜脈注射血漿濃度相近。之所以這樣是因為左氧氟沙星不僅在胃腸道中吸收速度快而且首過效應小，吸收基本完全。這一特性可以通過生物利用度來加以衡量，其絕 對生物利用度基本在99%左右。因此可以實現口服與靜脈注射的互換，給藥治療上具備天然優(yōu)勢。

       2 分布

       左氧氟沙星同樣可以保持和血漿濃度同樣的濃度穿透胎盤，并進入到母乳之中。但是左氧氟沙星難以穿透血腦屏障，在腦脊液中濃度僅為同時血漿濃度的16%，這可能表明左氧氟沙星（類似于其他氟喹諾酮類）在治療中樞神經系統(tǒng)或眼內感染方面的作用有限。與其他氟喹諾酮類藥物一樣，左氧氟沙星會積極滲透到吞噬細胞中，這有利于殺滅細胞內病原體。左氧氟沙星在吞噬細胞和其他組織中的大量積累導致可以觀察到觀察到的較大的Vd。將其暴露于 5 - 50mg/L的藥物濃度后，左氧氟沙星在中性粒細胞中的平均細胞內/細胞外濃度比范圍為 8.8 至 9.8mg/L。左氧氟沙星和其他氟喹諾酮類藥物在吞噬細胞內的積累不僅可以增強它們對細胞內病原體的活性，還可以通過在感染部位的組織和體液中維持高且持續(xù)的藥物濃度，從而提高抗細胞外病原體的活性。

       3 代謝和排泄

       圖18. 左氧氟沙星的代謝，來源：Clin-Pharmacokinet , 19977, 32, 101–119, Fish, D.N.et al.

       如圖17，左氧氟沙星的藥-時曲線可以采用二室模型，其特征為一級消除，曲線為雙指數衰減。因此可以方便的寫出其動力學過程的數學方程，進行給藥的數據計算。其數據無論是每日一次、兩次或三次口服或靜脈給藥基本保持線性和可預測的特性。

       左氧氟沙星的半衰期在9-11h左右，經過36-44h后，體內藥物含量達到穩(wěn)態(tài)血漿濃度的94%，在48h之后即達到穩(wěn)態(tài)，cmax值根據口服和靜脈注射分別為5.7和6.4mg/L，從而確保持久穩(wěn)定療效。

       已經在人、猴子、大鼠、狗中檢測出三種左氧氟沙星的代謝產物。這些代謝物是左氧氟沙星-D-葡萄糖醛酸苷 (M 1)、脫甲基-1-左氧氟沙星 (M2) 和左氧氟沙星-N-氧化物 (M3)。但在人類中僅鑒定了 M2 和 M3 代謝物。左氧氟沙星在人體中的代謝有限，主要以原形從尿液中排出。單次口服左氧氟沙星后，24 小時內只有不到 5% 的左氧氟沙星作為代謝物從尿液中排出（M2 和 M3 分別占劑量的約 1.75% 和 1.63%），≤5% 的劑量以無活性的 N-氧化物和去甲基代謝物形式存在，而約 79.6% 則以原型藥物的形式在接下來的 24 小時內排出。上述左氧氟沙星在人體中的代謝特征與氧氟沙星報道的相似。由于代謝物的形成可以忽略不計，因此它們幾乎沒有相關的藥理活性。

       05

       Levofloxacin的專利市場

       左氧氟沙星是重要的抗菌手性代表藥物在人類抗菌歷史上占據了非常重要的一部分，下面將介紹一下左氧氟沙星的專利市場部分：

       1 原研藥專利到期

       首先左氧氟沙星專利于2011年到期，同年美國FDA就批準了多家公司提交的左氧氟沙星通用名藥上市的申請，準許的劑型包括片劑、口服液、注射液等等。這樣國內許多公司也就加入到了左氧氟沙星仿制藥的研究和專利申請；不過值得一提的是由于左氧氟沙星的原研藥廠——日本第一三共株式會仍然擁有該兩款原研藥全部酸根、鹽基、劑型的專利，因此第一三共可以針對仿制藥展開合作和質量認定，從而在一定程度上保證了原研藥廠的一部分權利。

       2 中國的左氧氟沙星專利市場

       1、中國左氧氟沙星專利分布分析（不完全統(tǒng)計）

       圖19. 中國市場左氧氟沙星分布餅狀圖

       在國內，左氧氟沙星的專利主要有上圖幾個部分.

       其中，制備和純化檢測方法占據了33%的比例；各種藥物制劑又占據了30%左右；在其他里面的大部分專利，其實都是關于包裝盒設計的專利；

       這三個方面的專利就占據了中國左氧氟沙星專利的8成以上專利；

       而更為重要的晶型和化合物及其衍生物專利所占比例極少，這或許也是中國原研藥物不多的原因吧，核心技術專利掌握還有很大不足，這也是我們這一代人需要繼續(xù)奮斗的部分。

       2、中國的左氧氟沙星市場組成

       左氧氟沙星是原研廠家第一三共的主要產品之一，商品名可樂必妥（Cravit），于1993年上市。

       目前我國市售的左氧氟沙星注射液有原研藥和國產仿制藥兩類?！吨袊幏俊?016年論文顯示，國產仿制藥由于制備過程藥物溶解度和使用過程藥物生物利用度的不同有鹽酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽這3種不同酸根。國內現在市場上，鹽酸左氧氟沙星和乳酸左氧氟沙星銷售也比較多，存在藥劑形式也比較多，有片劑、滴劑、注射液等等。比如：左氧氟沙星片、鹽酸左氧氟沙星片等等……

       3 中國左氧氟沙星目前存在的挑戰(zhàn)和機遇

       1、左氧氟沙星目前存在的一些挑戰(zhàn)

       1）左氧氟沙星屬于第三代廣譜氟喹諾酮類抗菌藥物，是日本第一制藥株式會社開發(fā)上市的品種。左氧氟沙星抗菌作用強，對多數腸桿菌科細菌有較強的抗菌活性，而且對眼球感染性疾病的療效尤其顯著，因此，在國內外上市后頗受市場歡迎。

       2）但是隨著左氧氟沙星注射劑的大量應用，其不良反應問題也日益突顯，臨床用藥亮起黃燈。據IMS數據，2015年全球左氧氟沙星原研藥品市場創(chuàng)下了3.09億美元的新低，同比上一年下滑20.75%。

       3）2016年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）發(fā)布通告，提示急性鼻竇炎、急性支氣管炎和單純性尿路感染藥物治療時，氟喹諾酮類藥品抗菌治療引發(fā)相關嚴重不良反應的風險通常大于效益。

       隨著 2016 年門診輸液全面叫停，以及「能不用就不用、能少用就不多用，能口服不肌注、能肌注不輸液」的治療原則下，客觀上沖擊了左氧氟沙星市場，預測其增長率將有所下降。

       4）早在2011年1月，國家藥監(jiān)部門就發(fā)布了關注13個喹諾酮類藥品的不良反應通報，2013年11月再次發(fā)布通告，建議藥品生產企業(yè)加強藥品不良反應監(jiān)測，及時修訂氟喹諾酮類藥品的說明書，更新相關用藥風險信息及不良反應、注意事項等內容。最終在國家藥監(jiān)部門加大對喹諾酮類藥品不良反應的監(jiān)測及合理用藥的督導下，曾經一路火爆高漲的喹諾酮類藥物市場，逐漸在生產、銷售到終端市場各環(huán)節(jié)發(fā)生了變化。左氧氟沙星的銷量深受影響。

       2、左氧氟沙星的未來發(fā)展前景

       根據新思界產業(yè)研究中心發(fā)布的《2020-2024年中國喹諾酮類抗菌藥行業(yè)市場供需現狀及發(fā)展趨勢預測報告》顯示，在限抗令的影響下，我國抗菌藥物臨床應用逐漸合理化，對于喹諾酮類抗菌藥市場需求也有所降低。但由于喹諾酮類抗菌藥存在一定剛需性，且喹諾酮類抗菌藥不斷更新?lián)Q代，因此當前國內喹諾酮類抗菌藥市場規(guī)模保持穩(wěn)定發(fā)展，到2019年國內喹諾酮類抗菌藥物的市場規(guī)模約有128億元。并且根據最新的2021年的預測，未來5年左氧氟沙星的市場規(guī)模將會繼續(xù)增加。

       新思界醫(yī)藥行業(yè)分析人士表示，國內外市場對左氧氟沙星需求旺盛，且該藥臨床使用頻繁，其他沙星類藥物競品較少，預計未來很長一段時間，左氧氟沙星市場仍將繼續(xù)保持增長態(tài)勢。

       致謝

       感謝吳興新老師與文敏助教對文章的撰寫給予悉心指點，提出了寶貴的意見。

       關于筆者

       尋藥真理團

       他們是南京大學新藥研發(fā)策略課程的學生，本篇為該課程中新藥4組學生成員楊欣怡、江豪、吳栩喆、鄧高、沈雷共同完成。

       他們朝氣蓬勃、他們斗志昂揚，他們腳踏實地學習新藥研發(fā)知識，他們堅信吾愛吾師吾更愛真理。

       他們是新一代醫(yī)藥行業(yè)接班人，他們是新藥研發(fā)領域的未來之光！

       *本文僅為學術內容交流，不構成任何用藥建議！

       參考文獻

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       [2] Shen L L , Mitscher L A , Sharma P N, et al. Mechanism of inhibition of DNA gyrase by quinolone antibacterials: A cooperative drug-DNA binding model[J]. Biochemistry, 1989, 28(9):3886-3894.

       [3] Mitscher L A . Bacterial topoisomerase inhibitors: quinolone and pyridone antibacterial agents[J]. Chemical reviews, 2005, 105(2):559.

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