靶向蛋白降解(Targeted protein degradation, TPD)作為一種新興的治療策略被廣泛關(guān)注，它可以靶向以前被認(rèn)為“不可成藥”的蛋白質(zhì)。PROTAC是TPD的主要焦點，它同時招募并結(jié)合E3連接酶和靶蛋白(POI)，從而形成E3-降解蛋白POI三元復(fù)合物，誘導(dǎo)POI泛素化和隨后的蛋白體降解。
鑒于PROTAC巨大的治療潛力和獨特的機制，該領(lǐng)域引起了學(xué)術(shù)界和制藥行業(yè)的極大興趣，目前已有250種藥物被PROTACs進行降解測試。盡管PROTAC具有廣泛的治療潛力，但在人類基因組的數(shù)百種E3連接酶中，目前只有不到2%的E3連接酶參與了TPD領(lǐng)域的研究，因此，需要招募更多的E3連接酶來進一步增強TPD的治療潛力。
近日，美國國家癌癥中心的Eytan Ruppin教授和印第安納大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物統(tǒng)計與健康數(shù)據(jù)科學(xué)系Leng Han教授團隊研究人員對1075個E3連接酶進行了表征，最終確定了76種有潛力的E3連接酶，擴展了PROTAC的E3連接酶版圖，推動了PROTACs藥物的開發(fā)進展。
研究人員收集了E3連接酶的綜合列表(圖1a)，并利用大規(guī)模數(shù)據(jù)資源、實驗證據(jù)和人工智能(AI)工具來描繪E3連接酶的七個不同的關(guān)鍵維度：
化學(xué)配位性，表征E3連接酶的粘合劑可用性;
E3連接酶在腫瘤和正常樣本中單細胞水平和整體水平的表達模式;
進一步表征其潛在蛋白靶點的E3連接酶的PPI;
在PROTAC設(shè)計中應(yīng)優(yōu)先考慮的其他重要因素，包括結(jié)構(gòu)可用性、功能必要性、細胞定位和E3連接酶的PPI接口(圖1b)。
之后，他們基于三十個大規(guī)模數(shù)據(jù)集分析，包括3個E3連接酶列表、5個配體庫、5個表達圖譜、7個互作數(shù)據(jù)庫、2個結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫、2個重要性篩選、3個細胞定位數(shù)據(jù)庫和3種互作界面數(shù)據(jù)庫，研究人員揭示了幾種有前途的現(xiàn)存的E3連接酶。
PART.
01
化學(xué)配位性
表征E3連接酶的粘合劑可用性
為了尋找可能促進E3連接酶募集的新的藥物，研究人員采用基于深度學(xué)習(xí)的虛擬篩選配體模型HyperAttentionDTI31，在DrugBank25中搜索E3連接酶與藥物之間潛在的相互作用。
在評估和應(yīng)用該模型后，研究人員獲得了預(yù)測的藥物-靶標(biāo)相互作用，包括潛在的新型E3連接酶，如Makorin Ring Finger Protein 1 (MKRN1)，與關(guān)鍵腫瘤驅(qū)動因子TP53和APC32具有ppi，并預(yù)測與DB13955(雌 二醇二酸酯)和DB03017(月桂酸)相互作用。利用這些藥物可能會增加潛在的新型E3連接酶的配體性，從而靶向其他腫瘤靶點。他們系統(tǒng)分析利用了五個大規(guī)模的數(shù)據(jù)源，并揭示了許多新的E3連接酶和數(shù)十種可用的配體，這些配體可能用于PROTAC的開發(fā)。
PART.
02
E3連接酶在腫瘤和正常樣本中
單細胞及整體水平的表達模式
通過對腫瘤和正常組織的整合分析，研究人員確定了206個E3連接酶，包括3個增選的和203個新的E3連接酶，它們在TCGA和HPA病理中至少一種腫瘤類型中高表達，而在GTEx和Tabula及大多數(shù)正常組織中低表達。除了這3種被采用的E3連接酶，這203種潛在的新型E3連接酶揭示了一個大型的E3連接酶庫，可用于抗癌PROTAC的開發(fā)。
研究人員全面描繪了大細胞水平和單細胞水平的轉(zhuǎn)錄組表達，以及E3連接酶的蛋白質(zhì)組表達，證明了利用大規(guī)模表達數(shù)據(jù)進一步推進PROTAC提高療效和規(guī)避副作用的必要性。
PART.
03
E3連接酶與POI蛋白
相互作用(PPI)的綜合圖譜
蛋白質(zhì)被PROTAC降解的可能性因靶蛋白而異，總結(jié)E3連接酶相關(guān)的ppi應(yīng)優(yōu)先考慮能被PROTAC高降解的靶蛋白。為了確定這些PROTAC靶點，研究人員將PROTACtable基因組和基于模型的蛋白質(zhì)降解性分析(MAPD)兩項研究的結(jié)果結(jié)合起來，對靶點的PROTACtable可降解性進行了評估。這兩項研究突出了3280個PROTAC可處理靶點，其中1025個靶點重疊。
研究人員還發(fā)現(xiàn)了一些PPIs涉及PROTAC可治療的癌癥靶點，這些靶點尚未在PROTAC中被探索。例如，神經(jīng)母細胞瘤RAS(NRAS)與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的不良預(yù)后相關(guān)，有證據(jù)表明PPIs具有增選的E3連接酶BIRC2和XIAP，以及潛在的新型E3連接酶CDC20和SKP2。另一個PROTAC可處理的靶點是Rac Family Small GTPase 1 (RAC1)，它誘導(dǎo)乳腺癌的化療耐藥，與增選的E3連接酶MDM2和XIAP以及潛在的新型E3連接酶ITCH和SMURF2相互作用。在開發(fā)針對這些癌癥靶點的PROTACs時，可以考慮相應(yīng)的E3連接酶。
PART.
04
E3連接酶的結(jié)構(gòu)可用性、
功能必要性、細胞位置和PPI接口
首先，為了獲得E3連接酶的可用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，研究人員查詢了世界范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫protein Data Bank (PDB)，鑒定出414個具有實驗確定結(jié)構(gòu)的E3連接酶。這些可用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，為招募潛在的新E3連接酶提供了很好的機會。
然后，研究人員利用依賴圖譜(DepMap)61中的CRISPR和RNAi技術(shù)，研究了E3連接酶的遺傳擾動，評估了癌細胞系中基因的必要性。他們在CRISPR篩選中鑒定出146個腫瘤必需的E3連接酶，包括兩個增選的E3連接酶——VHL和RNF4。
緊接著，為了確定E3連接酶的細胞位置，研究人員整合了來自COMPARTMENTS、Gene Ontology (GO)和UniProt的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)983個E3連接酶被細胞質(zhì)和/或細胞核注釋，這被認(rèn)為是PROTAC的首選位置。這些潛在的新型E3連接酶，為實現(xiàn)受限或需要降解的亞細胞定位提供了一種通用的選擇。
最后，研究人員從多種來源收集到跨越928個E3連接酶，包括11個增選的E3連接酶的PPI界面?；诖丝梢灾笇?dǎo)人們確定E3連接酶或靶標(biāo)中觀察到的突變是否位于界面區(qū)域，從而可能進一步破壞E3連接酶與靶標(biāo)的相互作用。
PART.
05
局限與展望
然而，此研究目前也有一定的局限性，首先針對E3連接酶的研究主要集中在有限數(shù)量的E3連接酶上，如VHL/CRBN，缺少其他蛋白經(jīng)驗；其次由于目前缺乏大規(guī)模的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，無法更高分辨分析E3連接酶的活性，最后翻譯后修飾(PTM)在調(diào)節(jié)E3連接酶的活性和豐度（豐度指的是E3連接酶的相對含量）方面也起著關(guān)鍵作用。
PTM對PROTAC中E3的調(diào)控作用在很大程度上是未知的，大規(guī)模的高分辨率PTM數(shù)據(jù)還無法實現(xiàn)。因此，該網(wǎng)站為用戶提供了根據(jù)他們的偏好選擇數(shù)據(jù)源的選項。除了為PROTAC尋找新的E3連接酶外，E3連接酶的信息也可以被其他TPD領(lǐng)域所利用，如蛋白水解靶向抗體(PROTAB)和分子膠。
總之，該研究通過分析30個大規(guī)模數(shù)據(jù)集，從7個不同的方面系統(tǒng)地表征了E3連接酶，包括化學(xué)配體性、表達模式、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)、結(jié)構(gòu)可用性、功能必要性、細胞位置和PPI接口。揭示了幾種有前途的現(xiàn)存的E3連接酶。綜合置信度評分、配位性、表達模式和PPI，確定了76個E3連接酶作為PROTAC相互作用的候選酶。
此外，盡管新開發(fā)的PROTAC大部分用于癌癥治療，但研究人員對E3連接酶的綜合分析也可以從癌癥轉(zhuǎn)移到其他領(lǐng)域的治療開發(fā)，例如：治療神經(jīng)和/或免疫疾病。期待E3連接酶能夠持續(xù)助力PROTAC藥物的開發(fā)，造福更多患者！
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