在COVID-19疫情背景下，mRNA疫苗的快速崛起讓RNA療法成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)?；赗NA的疫苗創(chuàng)下了歷史上最快疫苗研發(fā)時(shí)間的記錄，從開發(fā)到獲FDA上市僅僅用時(shí)一年時(shí)間。發(fā)現(xiàn)了核苷堿基修飾的科學(xué)家更是憑此獲得了2023年諾貝爾獎(jiǎng)。 

       然而，mRNA疫苗在持久性和免疫原性等方面展現(xiàn)出的局限性，促使科學(xué)界積極尋求新的突破。正是這樣的背景下，被譽(yù)為“mRNA 2.0”的環(huán)狀RNA（circRNA）以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)被關(guān)注到。先進(jìn)國(guó)際期刊Nature發(fā)文稱“circRNA是RNA療法的下一代重磅技術(shù)”。

       1976年，circRNA首次被發(fā)現(xiàn)，但當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)mRNA剪接錯(cuò)誤帶來(lái)的副產(chǎn)物。2013年，Nature期刊同期發(fā)表了兩篇研究論文，確立了circRNA是一類具有調(diào)控作用的非編碼RNA，可以通過(guò)作為miRNA的海綿來(lái)調(diào)控其他基因表達(dá)。這讓沉寂30多年的circRNA一鳴驚人，并陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞分化、組織穩(wěn)態(tài)、疾病發(fā)展，以及免疫代謝中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。 

       2018年7月，是circRNA發(fā)展史上的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)，麻省理工學(xué)院（MIT）的 Daniel Anderson 等人在 Nature Communications 期刊發(fā)表論文，首次證實(shí)工程化的circRNA可在真核細(xì)胞中穩(wěn)定、高效表達(dá)蛋白，開創(chuàng)了外源circRNA在真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白的新應(yīng)用，也證明了circRNA是線性mRNA的有效替代品。

▲ circRNA研究的里程碑事件

       線性mRNA疫苗雖然研發(fā)周期短且易于實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)，但在RNA技術(shù)中有一個(gè)關(guān)鍵的缺陷，即其通常以線性形式存在，而這種形式存在的mRNA壽命很短。一般來(lái)說(shuō)，在幾個(gè)小時(shí)之內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的核酸酶就會(huì)將其降解掉。對(duì)于mRNA疫苗而言，其短暫的壽命并非什么大問(wèn)題，因?yàn)镽NA只需要很短的時(shí)間就能編碼出蛋白質(zhì)，從而引起免疫反應(yīng)。

       而對(duì)于大多數(shù)治療來(lái)說(shuō)，則需要讓RNA停留足夠長(zhǎng)的時(shí)間才能具有更長(zhǎng)的療效。這時(shí)候就需要在合成時(shí)對(duì)其進(jìn)行大量修飾，以抵抗細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解及避免引起先天免疫刺激，然后再通過(guò)脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送。整個(gè)過(guò)程效率低下，且價(jià)格昂貴。即便如此，修飾后的線性mRNA的半衰期還是較短。

       不同于線性mRNA，circRNA是一種獨(dú)特的單鏈RNA分子，其最顯著的特點(diǎn)在于其共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)形結(jié)構(gòu)，原本在線性RNA分子中存在的3'和5'末端被巧妙地連接在一起，這與傳統(tǒng)線性RNA截然不同。這一獨(dú)特的環(huán)形結(jié)構(gòu)賦予了circRNA諸多優(yōu)勢(shì)，不僅使其能夠有效抵御核酸酶的降解，還顯著提升了蛋白表達(dá)效率。同時(shí)，未修飾的circRNA具有較小的副作用，安全性能更高，且可以延長(zhǎng)抗原遞呈時(shí)間并保持長(zhǎng)久的免疫反應(yīng)，即使在低劑量水平，也可以增加其治病潛力，從而制造成本也大大降低。

▲ circRNA的形成

       遞送策略上，circRNA的遞送通常采用LNP、外泌體和病毒樣顆粒?？傮w而言，目前circRNA的遞送仍然廣泛采用LNP系統(tǒng)。但LNP也存在一些不容忽視的缺點(diǎn)，比如具有肝臟積累的傾向，肝外應(yīng)用受限等。外泌體和病毒樣顆粒則具有更強(qiáng)的生物兼容性。

       （關(guān)于外泌體如何賦能下一代CGT藥物開發(fā)，亦諾微創(chuàng)始人兼CEO周國(guó)瑛博士將于2024 年 9 月 4 日，在艾本德聯(lián)合醫(yī)麥客、ATLATL飛鏢創(chuàng)新研發(fā)中心舉辦的以“逐本未來(lái)，品質(zhì)為先”為主題的沙龍活動(dòng)--新一代 CGT 藥物創(chuàng)享交流會(huì)上分享。歡迎掃碼報(bào)名線上或線下參加。）

       circRNA作為下一代RNA療法的核心，有望治療各種難治性疾病，包括病毒性傳染病、腫瘤、病原菌感染、自身免疫性疾病、代謝性疾病等。

▲ circRNA的潛在應(yīng)用

       蛋白質(zhì)替代療法：其目的是恢復(fù)那些缺失或有缺陷的蛋白質(zhì)功能，通常是由基因突變導(dǎo)致。采用mRNA治療內(nèi)源蛋白缺失已應(yīng)用于多種疾病。相對(duì)于mRNA，circRNA結(jié)構(gòu)具有更高的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)間更長(zhǎng)，從而可以產(chǎn)生較高的蛋白質(zhì)累積并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，減少給藥頻率，且免疫原性較低。

       杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD），是由于 X 染色體上編碼抗肌萎縮蛋白的基因突變所導(dǎo)致的遺傳病，患者無(wú)法產(chǎn)生足夠的抗肌萎縮蛋白。Orna Therapeutics公司發(fā)現(xiàn)了使用circRNA-LNP進(jìn)行DMD的治療，可以實(shí)現(xiàn)持久高效的蛋白表達(dá)，甚至是長(zhǎng)編碼區(qū)蛋白的表達(dá)，且編碼全長(zhǎng)抗肌萎縮蛋白和截短體的circRNA均能在原代骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)。

       疫苗：疫苗接種的目標(biāo)是誘導(dǎo)強(qiáng)烈的適應(yīng)性免疫反應(yīng)和長(zhǎng)期免疫記憶。適應(yīng)性免疫記憶的誘導(dǎo)部分取決于抗原暴露的持續(xù)時(shí)間。與mRNA相比，circRNA固有的穩(wěn)定性延長(zhǎng)了蛋白質(zhì)翻譯的時(shí)間，增加了體內(nèi)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，長(zhǎng)期表達(dá)抗原可以更有效地誘導(dǎo)具有持久免疫記憶的免疫反應(yīng)。

       近日，復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院璩良等人發(fā)表了一篇文章，詳細(xì)解析了通過(guò)注射編碼HER2特異性腫瘤抗原的circRNA疫苗增強(qiáng)circRNA-CAR介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。

       癌癥免疫療法：采用機(jī)體免疫的作用成分如細(xì)胞因子、抗體和免疫細(xì)胞等進(jìn)行癌癥的治療。circRNA在癌癥免疫治療領(lǐng)域展現(xiàn)出多重優(yōu)勢(shì)，包括其可用于腫瘤個(gè)性化治療、高穩(wěn)定性確?？乖鞍椎姆€(wěn)定表達(dá)，以及誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。同時(shí)，circRNA固有的較低免疫原性對(duì)于腫瘤內(nèi)免疫刺激蛋白表達(dá)更具優(yōu)勢(shì)。

       細(xì)胞因子作為一類小型蛋白信號(hào)分子，已被證實(shí)具有增強(qiáng)抗腫瘤效果的能力。其中，白細(xì)胞介素-12（IL-12），作為細(xì)胞介導(dǎo)免疫的有效誘導(dǎo)劑，具有刺激活化 T 細(xì)胞和 NKT 細(xì)胞的效應(yīng)功能，在肺癌等實(shí)體瘤中顯示出良好的抗腫瘤作用。但由于它的脫靶毒性和給藥方式的低效性，其應(yīng)用受到限制。近日，多倫多大學(xué)李博文團(tuán)隊(duì)篩選出針對(duì)肺癌的H1L1A1B3 可電離脂質(zhì)，將其整合進(jìn)脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）。然后利用這些納米顆粒包封核酸，但包封的是 IL-12 circRNA，而不是IL-12 mRNA。將IL-12 circRNA 有效遞送到肺部腫瘤，并聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療（ICI），最終提高了肺癌免疫治療的效果。

       基因編輯：與mRNA相比，circRNA提供的穩(wěn)定性和穩(wěn)健表達(dá)可以使Cas9蛋白的持久性更長(zhǎng)，增加的蛋白表達(dá)可能會(huì)顯著提高基因編輯效率。

       在ADARs介導(dǎo)的RNA編輯中，2022年，魏文勝課題組設(shè)計(jì)并運(yùn)用了可招募ADAR的環(huán)形RNA（circ-arRNA），通過(guò)AAV遞送，遺傳編碼的circ-arRNA可以在人的原代細(xì)胞和類器官中實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)程的RNA編輯，這種可避免核酸外切酶切割的環(huán)狀RNA進(jìn)一步提升了體外和體內(nèi)編輯的效率和精準(zhǔn)性， 基本清除了雙鏈RNA區(qū)域內(nèi)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本上的脫靶。

       非編碼環(huán)狀RNA治療：circRNA在細(xì)胞內(nèi)具有內(nèi)源性非編碼功能，如miRNA和RNA結(jié)合蛋白海綿功能。circRNA作為調(diào)控RNA，具有作為miRNA和RNA結(jié)合蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑從而進(jìn)行治療的潛力。

       總的來(lái)說(shuō)，circRNA 的潛力和市場(chǎng)的熱情預(yù)示著其光明的前景，但其仍存在一些挑戰(zhàn)。比如如何精準(zhǔn)調(diào)控circRNA的表達(dá)水平，使其維持在適當(dāng)?shù)墓δ芩蕉粫?huì)過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致毒性，還需要進(jìn)一步開發(fā)；對(duì) circRNA 修飾需要進(jìn)行更深入的研究來(lái)進(jìn)一步降低circRNA的免疫原性。同時(shí)，遞送也是各應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)之一。相信隨著科研技術(shù)的不斷進(jìn)步，circRNA技術(shù)的持續(xù)改進(jìn)有助于其更廣泛的進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段。

       放眼全球，盡管這個(gè)賽道吸引了國(guó)內(nèi)外企業(yè)紛紛布局，然而目前還未有真正的circRNA藥物上市，所有在研管線都處于臨床階段，已入局的玩家?guī)缀醵际莿偲鸩絼?chuàng)業(yè)的生物醫(yī)藥公司。

       同樣，這個(gè)風(fēng)口也被MNC盯上，布局該領(lǐng)域的新銳公司都從融資市場(chǎng)攬獲了不小的支持。業(yè)內(nèi)人士戲稱，2021年堪稱circRNA相關(guān)企業(yè)的融資元年。

       Orna Therapeutics是全球首家利用circRNA技術(shù)開發(fā)新療法的公司，主要項(xiàng)目是一種原位CAR療法，它結(jié)合了circRNA分子和LNP技術(shù)，將CAR直接遞送至患者體內(nèi)的免疫細(xì)胞。據(jù)Orna Therapeutics官網(wǎng)所示，其主攻方向是利用circRNA的穩(wěn)定性制備原位CAR-T。

       另外，值得一提的是，Orna Therapeutics在人類細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了全長(zhǎng)抗肌萎縮蛋白編碼RNA的非病毒遞送，以及在小鼠模型中實(shí)現(xiàn)了較小長(zhǎng)度抗肌萎縮蛋白編碼RNA的體內(nèi)遞送。

       Orna Therapeutics成立于2019年，成立之初便獲得了1000萬(wàn)美元種子輪資金，2021年完成了1億美元的融資，截至2022年完成了2.21億美元的B輪融資，并與默沙東達(dá)成了一項(xiàng)總資金為36.5億美元的合作。

       著名風(fēng)投機(jī)構(gòu)Flagship于2021年投資5000萬(wàn)美元?jiǎng)?chuàng)立了Laronde。Laronde同樣布局circRNA賽道，其核心技術(shù)是自主研發(fā)的eRNA環(huán)化技術(shù)。成立僅3個(gè)月，Laronde就獲得了4.4億美元的B輪融資，是迄今為止circRNA公司獲得的最大的一筆融資。

       2023年，Laronde宣布和Flagship孵化的一家納米載體Senda Biosciences合并成為一家新公司——Sail Biomedicines，將Laronde的環(huán)狀RNA平臺(tái)和Senda的可編程納米顆粒平臺(tái)結(jié)合起來(lái)，開啟全面可編程的藥物開發(fā)。

       不僅是國(guó)際上布局circRNA的企業(yè)在瘋狂吸金，國(guó)內(nèi)不少企業(yè)也獲得了大筆融資。以圓因生物為代表的circRNA新銳企業(yè)，與國(guó)際企業(yè)齊頭并進(jìn)，紛紛打造了各自的技術(shù)平臺(tái)。

       圓因生物是國(guó)內(nèi)首家布局circRNA的企業(yè)，建立了體外高效制備高純度circRNA的技術(shù)平臺(tái)，針對(duì)新冠病毒及其變異株，設(shè)計(jì)了編碼新冠病毒刺突蛋白R(shí)BD的circRNA疫苗。2021年和2022年，圓因生物分別完成了超億元的Pre-A輪融資和2.8億元人民幣的A輪融資。

       除此之外，2021年成立的環(huán)碼生物也受到了資本的青睞，成為國(guó)內(nèi)首家circRNA融資企業(yè)。截至目前，環(huán)碼生物已經(jīng)完成了A輪融資，預(yù)估累計(jì)融資金額近4千萬(wàn)美元。

       環(huán)碼生物擁有多項(xiàng)自主研發(fā)專利，如基于II型內(nèi)含子自剪接核酶的活性可在體外環(huán)化任意RNA，其還建立了一套基于circRNA的高通量篩選系統(tǒng)可以高效篩選翻譯起始元件，并為circRNA建立了基于人工智能的序列優(yōu)化設(shè)計(jì)平臺(tái)。

       據(jù)悉，環(huán)碼生物曾接連兩度與MNC攜手。2023年7月，環(huán)碼生物與輝瑞就circRNA療法達(dá)成研發(fā)合作協(xié)議。今年2月，環(huán)碼生物宣布與BMS達(dá)成一項(xiàng)可行性研究合作。

       此外，國(guó)內(nèi)企業(yè)先博生物和國(guó)外circRNA領(lǐng)頭羊Orna Therapeutics還達(dá)成了合作。除了上述幾家企業(yè)之外，其他代表性的企業(yè)還有科銳邁德、博雅輯因、吉賽生物、博安生物等也已經(jīng)形成了具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的技術(shù)平臺(tái)。

       在此背景之下，還有部分企業(yè)著眼于解決痛點(diǎn)、難點(diǎn)問(wèn)題的核心專利技術(shù)上，如日前，艾博生物公布其自主研發(fā)的、擁有全球自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效RNA成環(huán)順式剪接系統(tǒng)（Cis系統(tǒng)），突破了海外PIE系統(tǒng)專利的限制，有望成為高效制備高質(zhì)量circRNA的突破性技術(shù)。放眼未來(lái)，本土創(chuàng)新想要避免發(fā)生“mRNA專利戰(zhàn)”的前車之鑒，只有提早突破海外壁壘，才能有望在circRNA技術(shù)得到大規(guī)模應(yīng)用之前，迅速搶占其帶來(lái)的無(wú)限潛力和廣闊的全球市場(chǎng)機(jī)遇。