細(xì)胞中的亞細(xì)胞器通常具有精細(xì)的三維結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞器的三維分布和動態(tài)有助于了解細(xì)胞功能和揭示細(xì)胞器之間的相互作用。然而，熒光顯微鏡受到光學(xué)衍射極限和物鏡數(shù)值孔徑（NA）的限制，只能獲得模糊的低分辨率圖像。由于寬場顯微鏡和共聚焦顯微鏡的軸向分辨率（約500-700納米）顯著低于其橫向分辨率（約200-300納米），因此在20世紀(jì)90年代，首先出現(xiàn)了提升軸向分辨率的成像技術(shù)：1992年，Stefan Hell開發(fā)了基于點(diǎn)掃描共聚焦的4Pi顯微成像技術(shù)，利用兩個(gè)對置物鏡采集兩個(gè)逆向傳播的波前并使之發(fā)生干涉，壓縮了成像系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF），使軸向分辨率提升至寬場顯微鏡的5-7倍。1995年，Mats Gustafsson提出了基于寬場照明的圖像干涉成像技術(shù)I5M ，在對置物鏡的架構(gòu)下，通過部分相干光形成駐波照明和熒光干涉寬場探測，同樣將軸向分辨率提升至寬場顯微鏡的5-7倍。

       進(jìn)入21世紀(jì)，研究人員陸續(xù)開發(fā)了眾多突破光學(xué)衍射極限的超分辨成像技術(shù)，包括受激發(fā)射損耗成像技術(shù)（STED），單分子定位成像技術(shù)（SMLM）以及結(jié)構(gòu)光照明成像技術(shù)（SIM）。將4Pi技術(shù)與這些超分辨技術(shù)相結(jié)合，誕生了一系列具備三維各向同性分辨率的超分辨顯微鏡系統(tǒng)。第一類是與STED技術(shù)結(jié)合：2008年，Stefan Hell課題組提出了isoSTED，利用4Pi技術(shù)壓縮三維環(huán)狀損耗光斑的光強(qiáng)零點(diǎn)大小，實(shí)現(xiàn)50納米各向同性分辨率；2016年，Stefan Hell課題組采用可逆光開關(guān)蛋白，開發(fā)了可應(yīng)用于活細(xì)胞的4Pi-RESOLFT；2021年，Joerg Bewersdorf課題組開發(fā)了AO isoSTED，通過引入自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)，在組織樣品上實(shí)現(xiàn)了三維50納米分辨率。第二類是與SMLM技術(shù)結(jié)合，利用4Pi技術(shù)采集熒光分子的自干涉圖樣，并根據(jù)干涉相位推斷單分子軸向位置。這包括Harald Hess課題組在2009年開發(fā)的iPALM，Alexander Egner課題組在2011年開發(fā)的4Pi-SMS，以及Joerg Bewersdorf課題組在2016年開發(fā)的W-4PiSMSN和2020年開發(fā)的多色4Pi-SMS。第三類通過將4Pi與3D-SIM相結(jié)合，引入六束照明光干涉和熒光干涉。2008年，Mats Gustafsson課題組的邵林博士開發(fā)了非相干結(jié)構(gòu)光照明圖像干涉顯微術(shù)I5S，在固定細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)了三維100納米各向同性分辨率。

       然而，在上述三維各向同性分辨率的超分辨成像系統(tǒng)中，isoSTED、iPALM和4Pi-SMS僅適用于固定細(xì)胞；4Pi-RESOLFT雖然可以用于活細(xì)胞，但成像速度慢，只能采集少數(shù)幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)用價(jià)值較低；I5S具有活細(xì)胞成像的潛力，但系統(tǒng)復(fù)雜且不穩(wěn)定，多年來缺乏硬件和算法的改進(jìn)，暫無生物學(xué)應(yīng)用場景。因此，在活細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)三維各向同性分辨率的快速超分辨成像，仍然是細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域長期夢寐以求的目標(biāo)。

       2024年12月23日，西湖大學(xué)章永登團(tuán)隊(duì)與北京大學(xué)黃小帥團(tuán)隊(duì)、重慶郵電大學(xué)范駿超團(tuán)隊(duì)、北京大學(xué)陳良怡團(tuán)隊(duì)合作，在 Nature Methods 期刊發(fā)表了題為：Elucidating subcellular architecture and dynamics at isotropic 100 nm resolution with 4Pi-SIM 的研究論文。

       該研究提出了一種新型4Pi-SIM超分辨顯微鏡架構(gòu)，以三維各向同性100 納米分辨率揭示了不同類型細(xì)胞中復(fù)雜精細(xì)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。4Pi-SIM首次在活細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)了三維各向同性100納米光學(xué)分辨率延時(shí)成像，成像時(shí)程可達(dá)數(shù)小時(shí)（500-600個(gè)時(shí)間點(diǎn)）。此外，4Pi-SIM還具備同時(shí)雙色成像能力，能夠捕捉三維空間內(nèi)不同細(xì)胞器之間的快速相互作用過程。

       研究團(tuán)隊(duì)基于4Pi單分子超分辨顯微鏡[11]和海森結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡的研究經(jīng)驗(yàn)，對4Pi-SIM顯微鏡的光學(xué)結(jié)構(gòu)和機(jī)械結(jié)構(gòu)進(jìn)行了精心設(shè)計(jì)（圖1），最大 程度地降低了熱波動和機(jī)械振動的影響，確保了六束光干涉對齊和熒光干涉的長期穩(wěn)定性；通過引入鎖焦模塊，系統(tǒng)能夠保證兩個(gè)物鏡精確對齊；通過設(shè)計(jì)光程差調(diào)節(jié)模塊，系統(tǒng)能夠快速、精確地將上下干涉臂的光程差微調(diào)至零；此外，系統(tǒng)采用新穎的I2M照明模塊，并改進(jìn)了重建算法，自適應(yīng)地估計(jì)和補(bǔ)償原始數(shù)據(jù)中系統(tǒng)光程差不匹配導(dǎo)致的相位誤差，從而最大限度地減少長時(shí)程成像時(shí)的重建偽影。

圖1：4Pi-SIM超分辨顯微鏡的原理圖和系統(tǒng)設(shè)計(jì)圖。a，4Pi-SIM系統(tǒng)原理圖。b，4Pi-SIM系統(tǒng)設(shè)計(jì)圖。

       上述改進(jìn)使4Pi-SIM能夠在三維空間內(nèi)以極 佳的清晰度和細(xì)節(jié)捕捉觀察各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。例如，研究團(tuán)隊(duì)利用4Pi-SIM成功展示了小鼠精母細(xì)胞中聯(lián)會復(fù)合體的雙螺旋結(jié)構(gòu)。而3D-SIM由于軸向分辨率不足，在軸向視野中錯(cuò)誤地合并了兩條染色體結(jié)構(gòu)（圖2a-c）。此外，研究團(tuán)隊(duì)還利用4Pi-SIM觀察了固定HeLa細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜通常在表面形成許多直徑為100-300納米的絲狀偽足。4Pi-SIM可以清晰地分辨出這些絲狀偽足在橫向和軸向的中空結(jié)構(gòu)。相比之下，3D-SIM的軸向視圖中無法分辨絲狀偽足的細(xì)節(jié)特征（圖2d-e）。

圖2：4Pi-SIM用于固定細(xì)胞三維超分辨成像。a-c，小鼠精母細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記聯(lián)會復(fù)合體的4Pi-SIM成像。d-e，HeLa細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)膜的4Pi-SIM成像。

       長時(shí)程成像實(shí)驗(yàn)需要保證4Pi-SIM中干涉腔的長期穩(wěn)定性，并在重建算法中對成像過程中系統(tǒng)光程差的漂移進(jìn)行補(bǔ)償。因此，活細(xì)胞成像相對于固定細(xì)胞而言更加具有挑戰(zhàn)性。研究團(tuán)隊(duì)利用4Pi-SIM對標(biāo)記線粒體外膜的HeLa細(xì)胞進(jìn)行延時(shí)成像，重建圖像展現(xiàn)出清晰的中空結(jié)構(gòu)，并捕捉到了線粒體的動態(tài)行為（圖3a-b）。在一個(gè)區(qū)域，研究團(tuán)隊(duì)觀察到棒狀線粒體轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃瓢急P的結(jié)構(gòu)（圖3c）；在另一個(gè)區(qū)域，則觀察到管狀線粒體從兩端生成納米管道，其直徑從約600納米減小到150納米（圖3d）。

       內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有錯(cuò)綜復(fù)雜的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并在活細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出顯著的動態(tài)特性。借助4Pi-SIM的超高時(shí)空分辨率，研究團(tuán)隊(duì)在COS-7細(xì)胞中觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的快速重組，并捕捉到管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逐漸形成片狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過程（圖3e-g）。

圖3：4Pi-SIM用于活細(xì)胞快速三維超分辨成像。a-d，HeLa細(xì)胞中線粒體的4Pi-SIM動態(tài)成像。e-g，COS-7細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的4Pi-SIM動態(tài)成像。

       多色成像對于研究三維空間中相鄰細(xì)胞器之間的動態(tài)相互作用至關(guān)重要。研究團(tuán)隊(duì)使用光穩(wěn)定性好的綠色熒光蛋白StayGold和一種大斯托克斯位移的熒光蛋白（dCyOFP2s）標(biāo)記樣本，在單色激發(fā)波長下實(shí)現(xiàn)了同時(shí)采集雙色熒光信號的活細(xì)胞成像。通過在活細(xì)胞中同時(shí)標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，研究團(tuán)隊(duì)觀察了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體的相互作用（圖4a-b），并捕捉到線粒體在兩個(gè)細(xì)胞器的接觸點(diǎn)發(fā)生了融合和分裂事件（圖4c-d）。此外，研究團(tuán)隊(duì)在活細(xì)胞中同時(shí)標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管狀網(wǎng)絡(luò)和微管錯(cuò)綜復(fù)雜地交織在一起，形成了橫跨細(xì)胞質(zhì)的動態(tài)互連（圖4e-f）。這些快速的相互作用促進(jìn)了兩種細(xì)胞器的重新排列（圖4g-h）。

圖4：4Pi-SIM同時(shí)雙色成像。a-d，HeLa細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（品紅色）和線粒體（綠色）的雙色4Pi-SIM動態(tài)成像。e-h，COS-7細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（品紅色）和微管（綠色）的雙色4Pi-SIM動態(tài)成像。

       4Pi-SIM 顯微鏡代表了活細(xì)胞三維超分辨顯微成像領(lǐng)域的重要進(jìn)展。自2008年Mats Gustafsson課題組的邵林博士開發(fā)I5S以來，改進(jìn)后的4Pi-SIM首次實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞上以三維各向同性100納米分辨率進(jìn)行數(shù)百個(gè)時(shí)間點(diǎn)的高質(zhì)量延時(shí)成像。正如Marcel Proust所言: "The real voyage of discovery consists not in seeking new landscapes, but in having new eyes." 4Pi-SIM顯微鏡在闡明納米尺度的亞細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)和動態(tài)行為等方面具有重要潛力，有望為細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展提供新的觀察視角和研究思路。

       論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02515-z