睡眠是動物體內(nèi)由晝夜節(jié)律和穩(wěn)態(tài)過程共同調(diào)節(jié)的一項重要生理活動。在果蠅、小鼠、狗和人類身上采用的遺傳學(xué)方法已被證明在揭示調(diào)控睡眠的基因方面十分有效。例如，包括在維持清醒方面發(fā)現(xiàn)的食欲素（也叫做下丘腦泌素）及其受體，以及在調(diào)節(jié)睡眠方面發(fā)現(xiàn)的鹽誘導(dǎo)激酶 3（SIK3）。
由于睡眠只能在動物身上進行測量，而無法在分子層面進行，因此該領(lǐng)域的研究人員都依靠電生理學(xué)和遺傳學(xué)來開啟果蠅和小鼠睡眠分子及機制的研究。
2024年12月30日，饒毅教授團隊在 Cell 子刊 Cell Chemical Biology 上發(fā)表了題為：Calcineurin: An essential regulator of sleep revealed by biochemical, chemical biological, and genetic approaches 的研究論文。
該研究以對睡眠至關(guān)重要的激酶的磷酸化位點為靶點，采用生物化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)鹽誘導(dǎo)激酶 3（SIK3）第 469 位蘇氨酸被丙氨酸取代（T469A）的小鼠的睡眠時間增加。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）在體外和體內(nèi)均可使 SIK3 的 T469 和 S551 位點去磷酸化，但 T221 位點不受影響。敲除 CaN 的調(diào)節(jié)亞基 PPP3R1，可使小鼠每天的睡眠時間減少超過 5 小時，這超過了所有已知的基因突變對小鼠睡眠時間的改變。
該研究揭示了鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）在睡眠中具有關(guān)鍵的生理作用，并開創(chuàng)了生化純化和化學(xué)生物學(xué)作為研究睡眠的有效方法。
對睡眠機制的研究傳統(tǒng)上依賴于電生理學(xué)和遺傳學(xué)。由于只能通過行為觀察和物理手段來測量整個動物的睡眠，因此沒有通過生化和化學(xué)生物學(xué)方法來開展睡眠研究。
在評估了這些策略的優(yōu)勢和局限性之后，饒毅團隊決定嘗試兩種方法：一種是采用經(jīng)典純化方法的生化方法，另一種是采用化學(xué)生物學(xué)方法的化學(xué)生物學(xué)方法。研究團隊的首個靶標(biāo)底物是 SIK3，此前筑波大學(xué)的柳澤正史團隊以及饒毅團隊已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其位點特異性磷酸化對睡眠調(diào)節(jié)十分重要。
由于SIK3中特定的磷酸化位點能夠指示睡眠需求并參與睡眠調(diào)節(jié)，研究團隊以該蛋白作為底物，通過生物化學(xué)方法鑒定其調(diào)控因子，然后測試這些體外磷酸化的生化調(diào)控因子是否也能調(diào)控動物的睡眠。
蛋白質(zhì)磷酸化在不同的睡眠-覺醒相關(guān)狀態(tài)下有所不同。哺乳動物的睡眠被認(rèn)為與 PKA、ERK、AMPK、CaMKIIα、CaMKIIβ、JNK、SIK3、SIK1、SIK2，以及 LKB1 有關(guān)。CaMK2b 基因敲除小鼠每天的睡眠時間減少超過 2小時，多于其他已知基因突變。
關(guān)于哺乳動物睡眠中的蛋白磷酸酶（PPase），目前仍知之甚少。20 世紀(jì) 70 年代發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)Calcineurin（CaN），直到 80 年代才確定其作為磷酸酶的功能。CaN（鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶）是唯一一種由鈣離子（Ca2+）和鈣調(diào)蛋白（CaM）激活的磷酸酶，它是一種二聚體，由催化亞基鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶A（PPP3CA、PPP3CB 或 PPP3CC）和調(diào)節(jié)亞基鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B（PPP3R1 或 PPP3R2）組成。PPP3CA、PPP3CB 和 PPP3R1 在體內(nèi)普遍表達，而 PPP3CC 和 PPP3R2 在睪丸中發(fā)揮重要作用。PPP3CA 是大腦中含量最豐富的催化亞基，而 PPP3R1 則是含量最豐富的調(diào)節(jié)亞基。
在確定 SIK3 中一個特定磷酸化位點：蘇氨酸（T）469的重要性后，研究團隊開始尋找 SIK3 的蛋白磷酸酶（PPase）。雖然SIK1和SIK2中絲氨酸（S）551等效位點的缺失導(dǎo)致了與 SIK3 中 S551 位點功能增益相同的表型，但研究團隊發(fā)現(xiàn)，Sik1 或 Sik2 基因的缺失并不影響小鼠的睡眠。因此，研究團隊重點關(guān)注 Sik3 基因。
SIK3 在 T469 和 S551 位點的 PKA 磷酸化增加了 SIK3 與 14-3-3 蛋白的相互作用。14-3-3 蛋白結(jié)合抑制 SIK3，而 T469 或 S551 的缺失增加了 SIK3 信號傳導(dǎo)。T469 的磷酸化的功能意義未知。
在這項最新研究中，研究團隊構(gòu)建了 SIK3 第 469 位的蘇氨酸到丙氨酸突變（T469A），并發(fā)現(xiàn) T469A 小鼠的睡眠增加。
我們采用了兩種方法來尋找 SIK3 的 T469 和 S551 位點的蛋白磷酸酶（PPase）：一種是經(jīng)典的生物化學(xué)方法，即從人 HEK293T 細(xì)胞中純化 T469 和 S551 的蛋白磷酸酶；另一種是化學(xué)生物學(xué)方法，即在小鼠腦中對與 SIK3 相互作用的蛋白質(zhì)進行光交聯(lián)。這兩種方法都發(fā)現(xiàn)了 PPP3CA ——鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）的催化亞基。
體外實驗表明，在存在鈣離子（Ca2+）、鈣調(diào)蛋白（CaM）和 PPP3R1 的情況下，PPP3CA 能夠使磷酸化的 T469 和 S551 去磷酸化。PPP3CA 無法使磷酸化的 T221 位點去磷酸化，而該位點的磷酸化可促進 SIK3 的活性，以提示睡眠需求并促進睡眠。
在敲低 PPP3CA、PPP3CB 或 PPP3R1 的 HEK293T 細(xì)胞中，Ca2+ 離子載體誘導(dǎo)的 T469 和 S551 位點的去磷酸化受到抑制，但 T221 位點的去磷酸化未受影響。當(dāng)敲低 PPP3CA 或 PPP3R1 時，T469 和 S551 位點的磷酸化在小鼠腦內(nèi)增加，而 T221 沒有增加。PPP3CA 敲低的小鼠，每天睡眠時間減少了大約3小時，PPP3R1 敲低的小鼠，每天睡眠時間減少超過 5 小時，這超過了所有已知基因突變導(dǎo)致的小鼠睡眠變化。
通過測量睡眠變化的程度，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）成為目前發(fā)現(xiàn)的最重要的睡眠調(diào)控因子。研究團隊表示，該研究成功發(fā)現(xiàn)了對睡眠至關(guān)重要的分子，顯示了生物化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)（以及遺傳學(xué)）在睡眠研究方面的驚人力量。
論文鏈接：https://www.cell.com/cell-chemical-biology/abstract/S2451-9456(24)00513-0
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