早期胚胎發(fā)育是生命科學(xué)領(lǐng)域的核心研究方向之一。胚胎從受精卵開(kāi)始發(fā)育，經(jīng)過(guò)基因組激活（zygotic genome activation，ZGA）、快速細(xì)胞分裂和譜系分化，最終形成囊胚，為胚胎著床及后續(xù)發(fā)育奠定基礎(chǔ)。在這一過(guò)程中，囊胚內(nèi)三譜系的形成——內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）、原始內(nèi)胚層（primitive endoderm，PrE）和滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm，TE）——標(biāo)志著胚胎命運(yùn)決定的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)。然而，受限于胚胎樣本的稀缺性和實(shí)驗(yàn)條件的限制，如何構(gòu)建精準(zhǔn)模擬早期胚胎發(fā)育的體外系統(tǒng)，仍是該領(lǐng)域亟待解決的科學(xué)難題。

2021 年，北京大學(xué)、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心杜鵬課題組通過(guò)抑制剪接體，首次捕獲并穩(wěn)定培養(yǎng)了小鼠全能性干細(xì)胞（mouse totipotent blastomere-like cells，mTBLC）。與經(jīng)典的多能性干細(xì)胞不同，mTBLC 能夠重現(xiàn)全能性卵裂球的特征，為構(gòu)建從單細(xì)胞開(kāi)始的分化和囊胚形成模型提供了理想的“種子細(xì)胞”。隨后，在 2024 年，杜鵬團(tuán)隊(duì)利用相同的策略成功獲得了人類全能性干細(xì)胞，為進(jìn)一步探索全能性及其在胚胎發(fā)育研究中的應(yīng)用提供了重要工具。

2025 年 1 月 17 日，杜鵬課題組在 Cell Stem Cell 期刊發(fā)表了題為：Mouse totipotent blastomere-like cells model embryogenesis from zygotic genome activation to post implantation 的研究論文。

在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步優(yōu)化了 mTBLC 的培養(yǎng)條件，并開(kāi)發(fā)了 mTBLC 自發(fā)分化和單細(xì)胞起始的類囊胚形成系統(tǒng)，mTBLC-類囊胚具有上胚層（EPI）、原始內(nèi)胚層（PrE）和胚外滋養(yǎng)層（TE）譜系，并能進(jìn)一步形成著床后階段的卵圓柱胚樣結(jié)構(gòu)，重現(xiàn)了從 ZGA 至囊胚形成的完整發(fā)育過(guò)程。這一突破為研究全能性、細(xì)胞命運(yùn)決定以及早期胚胎形態(tài)發(fā)生提供了新的技術(shù)平臺(tái)，也為早期發(fā)育的基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化研究開(kāi)辟了新的可能性。

在這項(xiàng)研究工作中，研究團(tuán)隊(duì)主要有以下發(fā)現(xiàn)：

1、該研究通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基（2MYCP），顯著提高了 mTBLC 的增殖速度和長(zhǎng)期自我更新能力，主要通過(guò)加入 2-DG、Minocycline、Y-27632、CHIR-99021 和 PlaB 等因子。在此過(guò)程中，PlaB 發(fā)揮了關(guān)鍵作用，通過(guò)抑制剪接驅(qū)動(dòng)了從多能性向全能性的轉(zhuǎn)變，而 Oct4 基因的去除并未影響 mTBLC 在 2MYCP 培養(yǎng)基中的自我更新能力，表明 Oct4 不是維持細(xì)胞全能性的必要條件。2MYCP 培養(yǎng)基中，Wnt 信號(hào)通路在 mTBLC 中被激活，且 Wnt 信號(hào)通路與細(xì)胞周期、增殖通路的激活與 mTBLC 的快速自我更新能力密切相關(guān)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制 Wnt 信號(hào)通路可顯著抑制 mTBLC 的增殖，證明 Wnt 信號(hào)對(duì)于 2MYCP 培養(yǎng)基中 mTBLC 的快速擴(kuò)增至關(guān)重要，但它并不參與維持 mTBLC 的全能性。

2、mTBLC 具有獨(dú)特的表觀基因組特征，這些特征有助于其全能性維持和快速自我更新。通過(guò) ATAC-seq 和 CUT&Tag 分析，發(fā)現(xiàn) mTBLC 的啟動(dòng)子區(qū)域（TSS）H3K27me3 和 H3K9me3 整體水平下降，而 H3K4me3、H3K27ac 和 RNA Pol II 標(biāo)記整體水平未發(fā)生顯著變化，其表觀特征與早期胚胎的初期胚胎細(xì)胞（如2細(xì)胞階段）相似。此外，mTBLC 具有比 PSC 更多的寬的 H3K4me3 域 （broad domain），以及更少的二價(jià)修飾基因（bivalent gene），且 MERVL 轉(zhuǎn)座子在 mTBLC 中具有顯著的 H3K4me3 標(biāo)記。Wnt 信號(hào)通路的激活進(jìn)一步增強(qiáng)了與細(xì)胞周期和增殖相關(guān)基因的 H3K4me3 富集，從而促進(jìn)了 mTBLC 的快速增殖。

3、該研究進(jìn)一步評(píng)估了 mTBLC 在體內(nèi)外的分化潛力。在嵌合體實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)單細(xì)胞數(shù)據(jù)，捕獲到了 EGFP 標(biāo)記的 mTBLC 生成的 13 種細(xì)胞，其中包括 7 個(gè)胚外譜系和 6 個(gè)胚內(nèi)譜系，證明了其在嵌合小鼠中的雙向發(fā)育潛能。此外，mTBLC 通過(guò)類胚體（EB）和畸胎瘤實(shí)驗(yàn)也都展示出了胚內(nèi)外雙向分化潛能，產(chǎn)生了包括神經(jīng)、心臟和腎臟等三胚層來(lái)源的細(xì)胞，也激活了包括經(jīng)典滋養(yǎng)層標(biāo)志基因，展示其能夠生成胚外滋養(yǎng)層樣譜系?？傮w而言，mTBLC 具有強(qiáng)大的雙向發(fā)育潛力，能夠分化為各種胚內(nèi)外譜系，成為評(píng)估全能干細(xì)胞發(fā)育潛力的重要工具。

4、該研究利用 mTBLC 建立了一個(gè)模擬胚胎著床前發(fā)育的體外分化模型，以克服現(xiàn)有體外分化系統(tǒng)的挑戰(zhàn)。在基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng) mTBLC 約 3-4 天后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，形成了胚胎干細(xì)胞（ESC）、胚外內(nèi)胚層干細(xì)胞（XEN）和滋養(yǎng)層干細(xì)胞（TSC）樣的克隆。RNA-seq 分析顯示，mTBLC 在分化過(guò)程中激活了不同發(fā)育階段的基因，經(jīng)歷了從早期初級(jí)基因組激活（minor ZGA）到主要基因激活（major ZGA）的轉(zhuǎn)變。免疫組化驗(yàn)證了 mTBLC 能夠分化為上胚層（EPI）、胚外滋養(yǎng)層（TE）和原始內(nèi)胚層（PrE）等譜系。單細(xì)胞 RNA 測(cè)序揭示，mTBLC 在分化過(guò)程中產(chǎn)生了涵蓋 2 細(xì)胞、4 細(xì)胞、8 細(xì)胞及囊胚階段的多種細(xì)胞類型，擬時(shí)間分析顯示 mTBLC 經(jīng)歷了兩次命運(yùn)決定，首次產(chǎn)生 TE 樣細(xì)胞和 ICM/EPI 樣細(xì)胞，隨后 ICM/EPI 樣細(xì)胞分化產(chǎn)生了 PrE 樣細(xì)胞。

研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在自發(fā)分化過(guò)程中，mTBLC 還產(chǎn)生了 Zscan4+ 和 Zscan4- 兩類基因組激活樣細(xì)胞（ZLC）。擬時(shí)間分析表明，只有 Zscan4- ZLC 能夠成功分化為 EPI、PrE 和 TE 三大譜系。因此，該研究提出，主要的 ZGA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能至少可以分為由 Zscan4 表達(dá)標(biāo)記的兩個(gè)獨(dú)立部分。同時(shí)，Zscan4 的表達(dá)可能并不是進(jìn)一步干細(xì)胞命運(yùn)決定所必需的。這一觀察結(jié)果也與人類 TBLC 的自發(fā)分化過(guò)程一致，在這一過(guò)程中，經(jīng)典的 ZGA 標(biāo)志基因（如 ZSCAN4/5A、DUXA/B 和 TPRX1 等）完全沒(méi)有被誘導(dǎo)表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)不僅進(jìn)一步證實(shí)了 mTBLC 的內(nèi)在全能性，也為探索哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中的共性機(jī)制提供了新視角。

5、研究還發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有任何外源性信號(hào)干預(yù)的情況下，單個(gè) mTBLC 能夠經(jīng)歷擴(kuò)增、極化和壓實(shí)過(guò)程，最終高效率地形成結(jié)構(gòu)完整的類囊胚（blastoid）。這一類囊胚結(jié)構(gòu)不僅包含內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、原始內(nèi)胚層和滋養(yǎng)外胚層等胚胎樣細(xì)胞，且未見(jiàn)異常中間狀態(tài)的細(xì)胞，mTBLC 來(lái)源的囊胚在轉(zhuǎn)錄組上與體內(nèi)囊胚更為接近，三個(gè)譜系的特定標(biāo)志物富集。并且類囊胚可以在體外繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)育成類似卵圓柱的后植入階段結(jié)構(gòu)。也可以將類囊胚移植到假孕小鼠中，其成功植入并形成卵圓柱樣著床后胚胎結(jié)構(gòu)。

綜上，該研究首次建立了基于 mTBLC 的自發(fā)分化和胚胎樣結(jié)構(gòu)形成系統(tǒng)，成功模擬了胚胎早期發(fā)育的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。尤其是在細(xì)胞命運(yùn)決定和全能性研究領(lǐng)域，這一系統(tǒng)為理解早期胚胎發(fā)育中的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變提供了新的視角。此外，該研究還為胚胎發(fā)育模型的應(yīng)用開(kāi)辟了新的可能性，未來(lái)基于這一系統(tǒng)，科學(xué)家們有望深入研究胚胎發(fā)育異常的分子機(jī)制，探索病理過(guò)程，甚至為解決不孕不育等生育醫(yī)學(xué)問(wèn)題提供全新解決方案。

論文鏈接：

https://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(24)00446-6