核基因組突變是多種疾病的根源，而線粒體作為細(xì)胞內(nèi)具有半自主功能的細(xì)胞器，擁有獨(dú)立的基因組，其基因組突變同樣與多種遺傳疾病密切相關(guān)。線粒體疾病通常累及多種組織器官，其中最為人熟知的包括 Leigh 綜合征和 LHON（Leber遺傳性視神經(jīng)病變）。Leigh 綜合征的癥狀包括發(fā)育遲緩、肌張力減退、運(yùn)動(dòng)和呼吸障礙等，而 LHON 則表現(xiàn)為視力喪失、中央暗點(diǎn)和視神經(jīng)萎縮等問題。根據(jù) MITOMAP 的統(tǒng)計(jì)，目前已驗(yàn)證的線粒體致病性突變有 97 個(gè)，其中點(diǎn)突變占比高達(dá) 95 %。然而，由于缺乏有效的點(diǎn)突變相關(guān)線粒體疾病小鼠模型，線粒體疾病的研究與治療開發(fā)受到了嚴(yán)重制約。
早期的小鼠模型主要通過化學(xué)誘導(dǎo)或遺傳工程構(gòu)建，但這些方法操作復(fù)雜、成本高昂且對(duì)突變的精準(zhǔn)控制較差，僅成功建立了極少數(shù)模型。近年來，研究人員成功開發(fā)了線粒體堿基編輯工具，可以對(duì)線粒體 DNA 實(shí)現(xiàn) C to T 和 A to G 的堿基編輯，例如 DdCBE 和 TALED。這些工具基于雙鏈 DNA 脫氨酶 DddA 蛋白。雖然已有研究者嘗試將這些工具應(yīng)用于小鼠模型的構(gòu)建，但其編輯效率尚不足以模擬人類線粒體疾病中高突變負(fù)荷的特征。此外，研究表明，DdCBE 可能引發(fā)大量核基因組脫靶效應(yīng)，這種非 TALE 依賴性的脫靶主要源于 DddA 蛋白的自組裝以及其與 CTCF 的相互作用。因此，基于 DddA 的線粒體堿基編輯工具在應(yīng)用中面臨核基因組脫靶的風(fēng)險(xiǎn)，難以直接建立線粒體突變與疾病表型之間的因果聯(lián)系。
2025年1月23日，昌平實(shí)驗(yàn)室、北京大學(xué)魏文勝團(tuán)隊(duì)在 Nature 期刊發(fā)表了題為：Precise modelling of mitochondrial diseases using optimized mitoBEs 的研究論文【1】。
該研究報(bào)道了通過優(yōu)化后的 mitoBE 實(shí)現(xiàn)高效且精準(zhǔn)地構(gòu)建線粒體疾病小鼠模型的成果。利用優(yōu)化版 mitoBE，研究團(tuán)隊(duì)成功建立了具有高突變頻率的小鼠模型，這些模型表現(xiàn)出了與疾病相關(guān)的典型表型。此外，通過雜交實(shí)驗(yàn)，還獲得了突變負(fù)荷達(dá)到 100% 以及僅含單堿基突變的精確小鼠模型。
2023 年 5 月，魏文勝團(tuán)隊(duì)在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Strand-selective base editing of human mitochondrial DNA using mitoBEs 的研究論文【2】。
該研究開發(fā)了一種名為 mitoBE 的全新線粒體單堿基編輯工具，該工具不依賴于 DddA 系統(tǒng)，能夠高效地實(shí)現(xiàn) A to G 或 C to T 的單堿基編輯。
還具備選擇性地編輯特定鏈的能力，這是 DddA 系統(tǒng)所不具備的。此外，該工具未觀察到明顯的脫靶現(xiàn)象。
此外，與 DdCBE 和 TALED 相比，mitoBE 展現(xiàn)出卓越的鏈特異性和顯著降低的脫靶效應(yīng)。得益于其雙向堿基編輯能力，mitoBE 能夠?qū)Υ蠹s 87% 的致病線粒體突變進(jìn)行精確建模。
為準(zhǔn)確建立突變與疾病表型之間的直接聯(lián)系，消除堿基編輯工具的脫靶效應(yīng)尤為重要。在利用 mitoBE 進(jìn)行建模時(shí)，需要將 RNA 編碼的 mitoBE 注射到小鼠受精卵中。因此，在這項(xiàng)新研究中，研究團(tuán)隊(duì)首先對(duì) RNA 編碼的 mitoBE 系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)進(jìn)行了全面評(píng)估。
結(jié)果表明，RNA 編碼的 mitoABE 存在廣泛的轉(zhuǎn)錄組脫靶效應(yīng)，而 mitoCBE 則表現(xiàn)出一定程度的依賴于 APOBEC1 蛋白的線粒體基因組脫靶效應(yīng)。為了提高 mitoBE 的精準(zhǔn)性，研究團(tuán)隊(duì)重點(diǎn)優(yōu)化了脫氨酶。
針對(duì) mitoABE，通過突變篩選發(fā)現(xiàn)，TadA8e-V106W-V28F 能夠顯著降低轉(zhuǎn)錄組脫靶至背景水平（圖1）。針對(duì) mitoCBE，篩選了多種現(xiàn)有的胞嘧啶脫氨酶，并發(fā)現(xiàn) TadA 衍生的胞嘧啶脫氨酶 CBE6d 在線粒體基因組上表現(xiàn)出的脫靶效應(yīng)接近背景水平。
基于這些優(yōu)化成果，研究團(tuán)隊(duì)將改進(jìn)后的 mitoBE 命名為 mitoBE v2，包括 mitoABE v2 和 mitoCBE v2（圖1）。此外，該研究還系統(tǒng)性地評(píng)估了優(yōu)化前后 mitoBE 在核基因組上的脫靶效應(yīng)，結(jié)果顯示，無論是優(yōu)化前還是優(yōu)化后的 mitoBE，均未在核基因組上引發(fā)明顯的脫靶效應(yīng)，從而驗(yàn)證了其在基因編輯中的安全性和可靠性。
圖1. 優(yōu)化mitoBEs的編輯精準(zhǔn)性
通過將 85 個(gè)人類致病性線粒體 DNA 點(diǎn)突變與小鼠線粒體基因組進(jìn)行同源性比對(duì)，研究團(tuán)隊(duì)確定了 70 個(gè)可編輯位點(diǎn)。進(jìn)一步的細(xì)胞水平初步篩選成功實(shí)現(xiàn)了其中 68 個(gè)位點(diǎn)的編輯。比較發(fā)現(xiàn)，由環(huán)狀 RNA（circRNA）編碼的 mitoBE v2 相比于線性 mRNA 編碼的工具，具有更高的編輯效率。
因此，研究團(tuán)隊(duì)將 circRNA 編碼的 mitoBE v2 注射至小鼠胚胎并進(jìn)行移植，結(jié)果顯示 mitoBE v2 在多種 F0 代小鼠模型中均實(shí)現(xiàn)了較高的編輯效率，其中 mt-Nd5 A12784G F0 小鼠模型的突變頻率高達(dá) 82%（圖2）。此外，該研究系統(tǒng)性評(píng)估了 F0 代小鼠在線粒體基因組和核基因組中的脫靶效應(yīng)，結(jié)果表明，在整個(gè)基因組范圍內(nèi)未檢測到脫靶效應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)表明，mitoBE v2 能夠構(gòu)建遺傳背景干凈的線粒體疾病小鼠模型。更重要的是，線粒體基因組的編輯結(jié)果在小鼠不同組織中表現(xiàn)出廣泛且持久的存在（圖2），并且能夠通過母系遺傳穩(wěn)定傳遞。通過進(jìn)一步雜交實(shí)驗(yàn)，研究成功獲得了目標(biāo)位點(diǎn)編輯效率達(dá)到 100% 以及僅含目標(biāo)位點(diǎn)突變的 mt-Nd5 A12784G 小鼠模型。
圖2. mitoBE v2高效構(gòu)建線粒體疾病小鼠模型，編輯結(jié)果廣泛且持久穩(wěn)定于多組織
mt-Atp6 T8591C 和 mt-Nd5 A12784G 分別對(duì)應(yīng)人類線粒體致病突變 m.T9191C 和 m.A13379G，并分別導(dǎo)致 Leigh 綜合征和 LHON。研究團(tuán)隊(duì)對(duì)突變率較高的 F0 代小鼠進(jìn)行了疾病表型評(píng)估，結(jié)果顯示，mt-Atp6 T8591C 小鼠表現(xiàn)出顯著的心臟功能障礙，與 Leigh 綜合征的臨床特征相符；mt-Nd5 A12784G 小鼠則表現(xiàn)出類似 LHON 的視力障礙（圖3）。此外，研究還通過調(diào)整 TALE 結(jié)合位點(diǎn)，成功構(gòu)建了僅含目標(biāo)位點(diǎn)編輯的單堿基突變 mt-Nd5 A12784G 小鼠模型。
圖3. 小鼠模型呈現(xiàn)出相應(yīng)的線粒體疾病表型
總的來說，這些研究結(jié)果充分證明了 mitoBE v2 在創(chuàng)建線粒體疾病小鼠模型方面的高效性和精準(zhǔn)性，為深入探索線粒體疾病的致病機(jī)制及開發(fā)新型治療策略提供了重要工具。
昌平實(shí)驗(yàn)室、北京大學(xué)魏文勝教授，北京大學(xué)博士后伊宗裔為論文共同通訊作者，昌平實(shí)驗(yàn)室博士后張小雪為論文第一作者，張雪、任紀(jì)武、李佳怡、魏曉旭和于瑩博士也為該研究做出了重要貢獻(xiàn)。該研究得到了昌平實(shí)驗(yàn)室、國家自然科學(xué)基金、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心及中國博士后科學(xué)基金的資助。
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