摘要：中國倉鼠卵巢（CHO）細胞在重組蛋白和單克隆抗體制備中應用廣泛，但傳統(tǒng)培養(yǎng)依賴的胎牛血清（FBS）存在諸多問題，因此無血清培養(yǎng)基（SFM）的研發(fā)意義重大。本文系統(tǒng)總結了 CHO 細胞的應用優(yōu)勢、高密度表達策略，以及無血清培養(yǎng)基從傳統(tǒng)血清替代物到微生物源物質的發(fā)展歷程，并闡述了其作用機制，旨在為 CHO 細胞無血清培養(yǎng)基的開發(fā)提供理論指導 。

一、CHO 細胞：生物制藥的 “明星細胞”

CHO 細胞的發(fā)展歷程：CHO 細胞自 1957 年被首次分離出來后，就因其具有無限增殖的能力，成為了生物技術領域的 “寵兒”。1987 年，Genentech 公司首次利用重組 CHO 細胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑，開啟了哺乳動物細胞表達系統(tǒng)在生物制藥領域的大規(guī)模應用 。之后，原始的 CHO 細胞經(jīng)過不斷馴化和基因工程改造，產(chǎn)生了如 CHO-K1、CHO-DXB11、CHO-DG44 和 CHO-S 等多種常用的細胞系（CHO 細胞發(fā)展譜系的圖1，幫助讀者更清晰地了解其發(fā)展脈絡 ）。

應用優(yōu)勢顯著：CHO 細胞之所以在生物制藥中應用廣泛，是因為它有很多突出的優(yōu)點 。首先，它具備精準的翻譯后修飾能力，能產(chǎn)生與人細胞糖基化類似的重組蛋白，這使得生產(chǎn)出的生物藥活性更高，與人體的相容性更好 。其次，它擁有強大的外源基因表達系統(tǒng)，像 DHFR 系統(tǒng)和 GS 系統(tǒng)，能利用外部壓力提高重組蛋白的合成效率 。再者，CHO 細胞感染病毒的風險較低，產(chǎn)生的內源性蛋白少，便于目標蛋白的純化和分離 。而且，它既能貼壁生長，也能懸浮生長，適合在生物反應器中進行無血清大規(guī)模培養(yǎng) 。

實現(xiàn)高效生產(chǎn)的策略：盡管 CHO 細胞有諸多優(yōu)勢，但目前其生產(chǎn)目標蛋白的效率與原核細胞和昆蟲細胞表達系統(tǒng)相比還有提升空間 ?？蒲腥藛T主要從細胞工程、代謝工程和優(yōu)化培養(yǎng)條件這幾個方面入手，來提高重組蛋白的生產(chǎn)效率 。其中，培養(yǎng)基的優(yōu)化至關重要 。比如，在氨基酸降解途徑中產(chǎn)生的抑制性副產(chǎn)物會影響細胞生長，去除這些副產(chǎn)物并添加如迷迭香酸等生物活性化合物，能促進 CHO 細胞的增殖 。此外，調整培養(yǎng)基中的鐵濃度也能提高蛋白產(chǎn)量，但需要注意避免鐵過量導致蛋白變色 。不過，不同實驗室和目標產(chǎn)品對培養(yǎng)基優(yōu)化的結果差異較大，開發(fā)適合特定細胞系的新培養(yǎng)基仍是當前研究的重點 。

二、無血清培養(yǎng)基：CHO 細胞培養(yǎng)的新方向

FBS 的局限與無血清培養(yǎng)基的興起：在 CHO 細胞的傳統(tǒng)培養(yǎng)過程中，通常需要添加 5% - 20% 的 FBS 來維持細胞的生長和傳代 。然而，F(xiàn)BS 存在不少問題，它的成分復雜，不同批次之間存在差異，這會導致培養(yǎng)基的質量不穩(wěn)定，影響生物過程的可靠性和穩(wěn)定性 。而且，F(xiàn)BS 還存在潛在的污染風險，可能攜帶內毒素、支原體、病毒等，并且全球 FBS 供應日益短缺，價格也比較昂貴，同時從動物福利的角度考慮，使用 FBS 也面臨著倫理問題 。因此，開發(fā)無血清培養(yǎng)基迫在眉睫 。

血清替代物的多樣探索：為了替代 FBS，研究人員進行了大量的探索，開發(fā)出了多種血清替代物（血清替代物發(fā)展的圖2，直觀呈現(xiàn)各類替代物 ）。

人血小板裂解物（HPLs）：HPLs 曾被認為是很有潛力的血清替代物，它含有多種生長因子和細胞因子，能促進細胞增殖 。但 HPLs 存在個體和批次間的差異，成分復雜且具有異源性，還存在傳播人類血源性病原體的風險，并且血液儲備的短缺也限制了它的大規(guī)模應用 。

動物源無提取物：這類替代物來源于植物、微生物等非動物源，通過物理或化學方法提取得到，含有多種營養(yǎng)元素 。像大豆、小麥、棉籽水解物等，添加到無血清培養(yǎng)基中不僅能促進細胞增殖、提高蛋白產(chǎn)量，還能改善產(chǎn)品質量，比如影響抗體的電荷異質性和糖基化模式（動物源無提取物應用效果的表格 1，呈現(xiàn)具體數(shù)據(jù) ）。不過，它們的成分復雜，有效成分和作用機制還不完全清楚，需要進一步研究來減少批次間的差異 。

益生菌和后生元：益生菌是一類對宿主有益的微生物，后生元則是益生菌的代謝產(chǎn)物或滅活菌體 。研究發(fā)現(xiàn)，它們對細胞增殖和重組蛋白表達有促進作用。比如，乳酸菌的無細胞上清液（CFS）能刺激細胞生長和免疫細胞增殖，其中的一些成分，如蛋白質、多糖、短鏈脂肪酸等，具有抗氧化、免疫調節(jié)等功能 。酵母提取物作為常用的益生菌細胞裂解物，富含營養(yǎng)，能顯著促進細胞生長和重組蛋白表達，但也可能會引起機體的不良反應，所以需要進行安全性評估 。從成本角度來看，許多植物源和微生物源的血清替代物成本較低，但由于來源和加工精度不同，其成本也有所差異（各類血清替代物成本對比的表格 2，讓讀者直觀了解 ）。

化學成分確定的培養(yǎng)基（CDM）：CDM 的所有成分都是明確的，不含有動物源蛋白或提取物，具有質量穩(wěn)定、批次間一致性好的優(yōu)點，有利于細胞代謝分析和重組藥物的安全生產(chǎn) 。早期的 F12 培養(yǎng)基是成功的 CDM 例子，但它在支持細胞高密度生長方面存在不足 。后來，通過將 F12 與 DMEM 按 1:1 混合，并添加激素、生長因子等添加劑，形成了 DMEM/F12 培養(yǎng)基 。隨著技術發(fā)展，科研人員利用化學計量分析等方法，不斷優(yōu)化培養(yǎng)基配方，提高細胞密度、活力和重組蛋白產(chǎn)量。在優(yōu)化過程中，常采用基于實驗設計（DoE）原則的傳統(tǒng)實驗設計方法，結合各種統(tǒng)計方法和人工智能技術，來確定關鍵影響因素（統(tǒng)計方法和人工智能在 CDM 優(yōu)化中應用的表格 3，呈現(xiàn)具體研究案例 ）。

三、無血清培養(yǎng)基對 CHO 細胞的作用機制

調節(jié)細胞能量代謝：葡萄糖是細胞能量代謝的重要底物，但在無血清懸浮培養(yǎng)中，它往往是限制因素，需要不斷補充 。一些動物源無提取物可以上調細胞能量代謝途徑中的相關蛋白，加速糖酵解和三羧酸循環(huán)，為細胞生長和生物合成提供更多能量 。不過，葡萄糖代謝會產(chǎn)生乳酸，乳酸積累過多會對細胞有毒害作用 。使用乳糖、果糖等低碳分子糖類作為能量底物，能降低細胞滲透壓，減少乳酸生成 。此外，像\(Mn^{2+}\)、\(Cu^{2+}\)、\(Zn^{2+}\)等微量元素，在細胞能量代謝和抗氧化應激中發(fā)揮著重要作用，它們可以作為酶的輔助因子，參與多種代謝過程 。

促進細胞生長和增殖：在 CHO 細胞的分批補料培養(yǎng)中，調節(jié)細胞周期和抑制細胞凋亡對細胞生長和提高細胞特異性生產(chǎn)力很關鍵 。酵母提取物可以通過抑制細胞周期蛋白（Cyc）和周期蛋白依賴性激酶（Cdk）的表達，使細胞周期停滯在 G0/G1 和 G2/M 期，同時維持培養(yǎng)基中豐富的營養(yǎng)環(huán)境，激活 mTOR 信號通路，促進細胞生長和蛋白合成 。多胺類物質，如精胺和腐胺，對 CHO 細胞的正常生長和增殖也至關重要，它們可以通過調節(jié)細胞周期和促進細胞對鐵的吸收來發(fā)揮作用 。此外，一些益生菌，如雙歧桿菌的裂解物，能通過激活 Wnt/β - catenin 和 PI3K/Akt/mTOR 信號通路，抑制腫瘤壞死因子誘導的細胞凋亡，促進腸道上皮細胞的增殖 。

促進重組蛋白合成和分泌：血清替代物和其他化學補充劑促進重組蛋白生產(chǎn)的機制是多方面的，涉及外源基因從轉錄、翻譯到蛋白折疊、組裝和分泌的整個過程 。動物源無提取物可以通過提高細胞活力和調節(jié)相關信號通路，來顯著提高重組蛋白的合成效率 。一些小分子有機酸，如丁酸、戊酸等，可以通過表觀遺傳修飾激活轉錄因子，影響基因表達和調控 。翻譯過程中，許多具有生長因子活性的氨基酸和寡肽可以上調 PI3K 和 mTOR 蛋白的表達，激活 PI3K/Akt/mTOR 信號通路，促進 RNA 在核糖體上的翻譯和延伸 。此外，酵母提取物中的\(Ca^{2+}\)和富含精氨酸的寡肽可以與內質網(wǎng)分子伴侶結合，加速蛋白折疊和組裝，促進蛋白分泌 。棉籽水解物則可以上調內質網(wǎng)中的熱休克蛋白和伴侶蛋白，提高重組蛋白的合成和分泌效率 。

四、總結與展望

CHO 細胞在生物制藥領域有著不可替代的地位，而開發(fā)新型無血清培養(yǎng)基是提高其培養(yǎng)性能和重組蛋白產(chǎn)量的關鍵 。目前的許多血清替代物和 CDM 在提高 CHO 細胞的整合活細胞密度（IVCD）和蛋白產(chǎn)量方面表現(xiàn)出色，它們通過改善細胞能量代謝、調節(jié)細胞周期、抑制細胞凋亡以及增強外源基因的轉錄、翻譯和蛋白折疊分泌等過程發(fā)揮作用。

隨著生物技術的不斷進步以及人們對動物福利和環(huán)境保護意識的增強，動物源無提取物的開發(fā)和應用將獲得更大的推動力。但研究人員仍需不斷探索新型動物源無提取物，優(yōu)化其成分和制備方法，提升性能、降低成本，并確保其安全性和有效性，以滿足生物制藥、細胞培養(yǎng)、組織工程和醫(yī)學診斷等多領域的需求，使其性能更接近甚至超越傳統(tǒng)動物血清，成為理想的血清替代品，為市場帶來更多創(chuàng)新和機遇。

鑒于益生菌對健康的有益作用已得到廣泛認可，探索其作為哺乳動物細胞血清替代品的潛力具有重要意義。同時，益生菌產(chǎn)生的后生元也展現(xiàn)出促進細胞生長和組織修復的生物活性。因此，需要深入鑒定和表征具有最佳促生長和增產(chǎn)特性的特定益生菌菌株及其代謝產(chǎn)物，明確其作用機制和活性成分，并通過數(shù)學統(tǒng)計或人工神經(jīng)網(wǎng)絡等方法，制定標準化方案和優(yōu)化配方，將潛在的血清替代物和營養(yǎng)因子融入 CHO 細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。

總體而言，探索包括動物源無提取物和后生元在內的更多血清替代物，對于以可持續(xù)且符合生物學規(guī)律的方式提升 CHO 細胞培養(yǎng)技術具有巨大潛力。這種創(chuàng)新方法有望在生物制藥、基因治療和細胞培養(yǎng)肉等多個領域發(fā)揮越來越重要的作用。