PROTAC技術(shù)后，DUBTAC揭示新型靶向治療的未來(lái)

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作者：balabala 來(lái)源：藥渡網(wǎng)

2024-07-10

靶向嵌合體蛋白水解（PROTAC）技術(shù)代表了藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的突破性發(fā)展，利用泛素蛋白酶體系統(tǒng)特異性降解與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，多項(xiàng)目已進(jìn)入臨床開發(fā)。但針對(duì)CF和某些癌癥，需開發(fā)靶向蛋白穩(wěn)定劑TPS以對(duì)抗異常蛋白降解。

靶向蛋白質(zhì)穩(wěn)定技術(shù)（targeted protein stabilization，TPS）是近年來(lái)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一種新興的技術(shù)，旨在通過(guò)特定的方法來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，從而影響其功能和行為。這種技術(shù)潛在應(yīng)用廣泛，從基礎(chǔ)研究到新藥開發(fā)都有重要價(jià)值。

去泛素化酶靶向嵌合體（deubiquitinase-targeting chimeras，DUBTACs）是近年來(lái)逐漸發(fā)展的一種靶向蛋白質(zhì)穩(wěn)定技術(shù)，DUBTACs一般由靶蛋白配體、去泛素化酶配體和Linker三部分組成，這樣的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)使得DUBTAC分子可以同時(shí)結(jié)合靶蛋白和去泛素化酶，誘導(dǎo)靶蛋白和去泛素化酶靠近，去除靶蛋白上的泛素鏈，從而達(dá)到穩(wěn)定以泛素化依賴方式降解的特定蛋白質(zhì)的水平（圖1）。

圖1. DUBTAC平臺(tái)

在這里，我們總結(jié)了近年來(lái)DUBTAC技術(shù)的研發(fā)進(jìn)展，詳細(xì)探討了其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景和潛在挑戰(zhàn)。

基于OUTB1的DUBTACs

在2022年初，加州大學(xué)伯克利分校的Daniel K. Nomura教授團(tuán)隊(duì)運(yùn)用基于活性的蛋白質(zhì)圖譜分析（activity-based protein profiling, ABPP）對(duì)65種去泛素化酶的反應(yīng)性半胱氨酸進(jìn)行全局性分析。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，泛素化酶OTUB1的C23位點(diǎn)不參與酶活性的調(diào)控且具有較高的親核性，是一個(gè)理想的配體結(jié)合位點(diǎn)。由于細(xì)胞中主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的最豐富的泛素鏈?zhǔn)荎48鏈，而OTUB1則是靶向移除K48鏈的去泛素化酶。

理論上，利用OTUB1去針對(duì)性地去除特定蛋白上的泛素鏈，防止以泛素化依賴方式被降解的特定蛋白質(zhì)被蛋白酶體降解，是非常有效的。

圖2. EN523結(jié)構(gòu)

（1）ΔF508-CFTR-DUBTACs

Daniel K. Nomura教授團(tuán)隊(duì)基于上述發(fā)現(xiàn)篩選出了一個(gè)與OUTB1高親和力結(jié)合的共價(jià)配體EN523（圖2）。其中，EN523與OTUB1結(jié)合是通過(guò)EN523的丙烯酰胺部分與OTUB1變構(gòu)半胱氨酸殘基Cys23共價(jià)作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。他們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明EN523對(duì)OTUB1的酶活性沒有顯著影響。

隨后，研究人員將篩選到的EN523與ΔF508-CFTR調(diào)節(jié)劑Lumacaftor連接起來(lái)所獲得的異源雙功能小分子NJH-2-057用于靶向CFTR突變體ΔF508-CFTR的穩(wěn)定從而改善囊性纖維化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NJH-2-057可以有效穩(wěn)定ΔF508-CFTR，而單獨(dú)使用Lumacaftor的結(jié)果則與對(duì)照組差異不明顯（圖3）。這一結(jié)果為DUBTAC技術(shù)的發(fā)展提供了概念驗(yàn)證。

圖3. NJH-2-057穩(wěn)定CFTR

（2）WEE1-DUBTACs

Daniel K. Nomura教授團(tuán)隊(duì)隨后將DUBTAC技術(shù)應(yīng)用于提高抑癌基因WEE1的穩(wěn)定性，WEE1是一種非惡性真核體細(xì)胞中的腫瘤抑制激酶，可磷酸化細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK1）-細(xì)胞周期蛋白B1復(fù)合物，以抑制有絲分裂S期和G2期的細(xì)胞周期進(jìn)展，并且必須下調(diào)其活性才能發(fā)生有絲分裂進(jìn)展。WEE1在許多腫瘤中被降解以促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。穩(wěn)定癌細(xì)胞中WEE1激酶的水平有望阻止腫瘤生長(zhǎng)。

研究人員將EN523與一種臨床WEE1抑制劑AZD1775通過(guò)烷基鏈linker或基于聚乙二醇的linker連接合成了靶向腫瘤抑制性激酶WEE1的DUBTAC。研究顯示，DUBTAC能顯著穩(wěn)定肝癌細(xì)胞系中的WEE1，而EN523或AZD1775單獨(dú)治療對(duì)WEE1水平?jīng)]有影響（圖4）。

圖4. WEE1 DUBTAC穩(wěn)定WEE1

這進(jìn)一步證明了DUBTAC技術(shù)用于TPS的普適性，此外，Daniel K. Nomura教授團(tuán)隊(duì)的研究也強(qiáng)調(diào)了使用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)支持的共價(jià)配體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的實(shí)用性。

（3）TF-DUBTACs

2022年6月份，來(lái)自美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院的Wenyi Wei教授團(tuán)隊(duì)在此前研究的基礎(chǔ)上，使用EN523招募去泛化素酶OTUB1進(jìn)一步開發(fā)了能夠穩(wěn)定抑癌轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factor，TF）的首個(gè)TF-DUBTAC藥物平臺(tái)，旨在通過(guò)穩(wěn)定TF實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的治療（圖5）。

圖5. TF-DUBTAC平臺(tái)示意圖

研究人員分別將FOXO3A、p53、IRF3三種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合配體疊氮基修飾DNA寡核苷酸與BCN（bicyclononyne）修飾的去泛素化酶OUTB1的共價(jià)配體（DUBL-X-BCN 1-10）通過(guò)SPAAC反應(yīng)連接起來(lái)，設(shè)計(jì)合成出了一系列靶向FOXO3A、p53、IRF3三種轉(zhuǎn)錄因子的DUBTAC分子（圖6），緊接著，研究人員通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定了細(xì)胞水平上化合物對(duì)靶蛋白的穩(wěn)定作用，并篩選出有效的TF-TUBTAC分子，細(xì)胞水平活性測(cè)試研究表明，相應(yīng)的TF-DUBTAC 以O(shè)UTB1依賴的方式分別穩(wěn)定了細(xì)胞內(nèi)的FOXO3A、p53、IRF3。

圖6. TF-DUBTAC作用機(jī)理圖示

這進(jìn)一步說(shuō)明了TF-DUBTAC是一個(gè)可推廣的平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)抑癌轉(zhuǎn)錄因子的選擇穩(wěn)定性，可作為抑制腫瘤生成的治療手段。同時(shí)也表明DUBTAC技術(shù)在癌癥治療方面的普適性和有效性。

基于USP7的DUBTACs

由于基于去泛素化酶OTUB1共價(jià)配體開發(fā)出的DUBTACs可能與其他共價(jià)抑制劑類似存在毒性或超敏反應(yīng)等劣勢(shì)，因此，開發(fā)基于其他去泛素酶的可逆招募配體是TPS領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。

2024年4月份，美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院的Wenyi Wei教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了第一個(gè)基于去泛素化酶USP7的DUBTAC，其利用USP7的非共價(jià)配體實(shí)現(xiàn)了選擇性穩(wěn)定CFTR和AMPK蛋白的目的（圖7）。

圖7.USP7-DUBTAC平臺(tái)示意圖

（1）ΔF508-CFTR-DUBTACs

首先，研究人員選擇先前報(bào)道過(guò)的USP7 ligand #1作為去泛素化酶USP7的配體，通過(guò)分析配體與USP7復(fù)合物的共晶結(jié)構(gòu)，選擇配體分子USP7i-#4a結(jié)構(gòu)中位于結(jié)合口袋外的氨基作為linker連接位點(diǎn)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)。

研究人員將USP7 ligand#1與ΔF508-CFTR調(diào)節(jié)劑Lumacaftor通過(guò)linker連接合成了一系列的靶向CFTR的DUBTAC的分子，并在細(xì)胞水平上測(cè)定化合物對(duì)CFTR蛋白的穩(wěn)定作用（圖8）。

圖8.基于usp7的dubtac來(lái)穩(wěn)定靶蛋白

研究結(jié)果表明，化合物MS6869以相對(duì)特定的方式促進(jìn)了CFTR的穩(wěn)定，其有效性與先前報(bào)道的基于OTUB1的CFTR-DUBTAC相當(dāng)。

（2）AMPK-DUBTACs

隨后，研究人員基于兩種不同的USP7配體設(shè)計(jì)并合成了一系列的靶向AMPK的DUBTAC分子（圖8），并對(duì)這些化合物進(jìn)行AMPK蛋白穩(wěn)定作用測(cè)試，研究表明，不同的USP7配體衍生的AMPK-DUBTAC可以選擇性地穩(wěn)定AMPK β的不同亞型，導(dǎo)致AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)升高。

這些結(jié)果無(wú)一不說(shuō)明了基于USP7的DUBTAC技術(shù)開發(fā)的可行性。

展望

DUBTAC技術(shù)的出現(xiàn)，使得許多領(lǐng)域有望從主動(dòng)泛素化和降解蛋白的靶向去泛素化中獲益。例如穩(wěn)定線粒體中的BAX水平以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，穩(wěn)定STING用于免疫腫瘤學(xué)應(yīng)用或在胰腺細(xì)胞中穩(wěn)定葡萄糖激酶用于成年發(fā)病型糖尿病2型。其他受益于DUBTAC的靶標(biāo)包括各種為了維持癌細(xì)胞增殖而被主動(dòng)泛素化和降解的腫瘤抑制因子。

除了囊性纖維化之外，還有許多其他遺傳疾病也可以通過(guò)dubtac穩(wěn)定獲益。包括高雪氏病或帕金森病中的葡萄糖腦苷脂酶突變和苯丙酮尿癥中的苯丙氨酸羥化酶和富馬酰乙酰乙酸羥化酶突變等。

我們總結(jié)了近年來(lái)DUBTAC技術(shù)的研究進(jìn)展，展現(xiàn)了DUBTAC技術(shù)在提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定效率方面的顯著優(yōu)勢(shì)，我們也對(duì)DUBTAC技術(shù)的發(fā)展前景做出了展望，期待更多研究者能夠加入這一創(chuàng)新領(lǐng)域，共同推動(dòng)生物醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展。

編者按：

DUBTAC通過(guò)穩(wěn)定關(guān)鍵蛋白質(zhì)來(lái)對(duì)抗疾病，如CFTR和WEE1，已在實(shí)驗(yàn)室研究中取得初步成功。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，基于USP7等其他去泛素酶的DUBTAC也在開發(fā)中，有望克服現(xiàn)有技術(shù)的局限性。展望未來(lái)，DUBTAC技術(shù)有望在更多領(lǐng)域發(fā)揮作用，為治療各種疾病提供新的策略。

參考文獻(xiàn)

[1]Deubiquitinase-targeting chimeras for targeted protein stabilization

[2]TF-DUBTACs Stabilize Tumor Suppressor Transcription Factors

[3]USP7-Based Deubiquitinase-Targeting Chimeras Stabilize AMPK

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