益生菌對人體健康發(fā)揮諸多積極作用，但由于益生菌在加工貯藏和消化過程中會發(fā)生活性損失，直接口服益生菌很難達(dá)到預(yù)期的益生效果。因此，需要將益生菌封裝到具有保護(hù)和靶向遞送作用的載體中，提高 益生菌對外界和消化道內(nèi)極端環(huán)境的耐受性。目前用于實現(xiàn)益生菌腸道靶向輸送的口服遞送系統(tǒng)包括微膠囊、水凝膠、油凝膠、納米涂層、乳液、納米纖維、孢子、生物膜等。

       1、微膠囊

       微膠囊是由食品大分子通過噴霧干燥法制備的具有核殼結(jié)構(gòu)的保護(hù)載體，可以將益生菌和外界環(huán)境隔絕，實現(xiàn)益生菌的控制釋放。制備微膠囊的常用壁材包括海藻酸鹽、殼聚糖、明膠和果膠等。幾乎所有的益生菌微膠囊化技術(shù)都包含干燥過程，常采用噴霧干燥、冷凍干燥、電噴霧、乳化等方法制備益生菌微膠囊。噴霧干燥是一種快速且相對便宜的制備微膠囊的方法，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以通過形成二硫鍵增強蛋白質(zhì)機械強度，從而在噴霧干燥過程中保護(hù)益生菌免受高溫?fù)p傷。乳清分離蛋白也可以在噴霧干燥過程中起到保護(hù)益生菌的作用，研究發(fā)現(xiàn)乳清分離蛋白可以與鼠李糖乳桿菌菌毛上的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，在菌體表面形成蛋白質(zhì)層，提高 益生菌耐熱性和抗氧化性。

       2、水凝膠

       水凝膠是由親水食品大分子通過物理或化學(xué)交聯(lián)而形成的具有吸水膨脹性的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，廣泛應(yīng)用于益生菌/功能因子遞送、藥物遞送、3D細(xì)胞培養(yǎng)支架和組織工程等領(lǐng)域。益生菌可以封裝在水凝膠微球的內(nèi)部或接種在微球表面。海藻酸鹽是最常用的水凝膠封裝材料之一，它可以與Ca2＋結(jié)合，形成水凝膠交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。通過海藻酸鹽、果膠和明膠的生物復(fù)合水凝膠封裝植物乳桿菌，可以顯著提高植物乳桿菌的胃酸耐受性，孵育6 h后，模擬胃液中的植物乳桿菌存活率比游離植物乳桿菌高26%，并且貯藏4 周后，包埋的益生菌具有更高的氧化穩(wěn)定性。不過，傳統(tǒng)的合成水凝膠在被稀釋后機械強度會降低，表現(xiàn)出溶脹弱化的現(xiàn)象，不利于益生菌封裝系統(tǒng)的穩(wěn)定。有研究開發(fā)了一種溶脹強化水凝膠，將脂質(zhì)體膜納米屏障共嵌入水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，溶脹過程中水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)拉伸，導(dǎo)致脂質(zhì)體膜納米屏障變形，封裝物質(zhì)跨膜擴散，形成新的網(wǎng)絡(luò)，這種雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增強了機械強度。

       微米尺度的水凝膠稱為微凝膠。用于制造微凝膠的材料通常是生物聚合物，例如淀粉、海藻酸鹽、角叉菜膠等，它們是具有多孔聚合物分子網(wǎng)絡(luò)的生物聚合物顆粒，多數(shù)是全天然無毒材料，可以保護(hù)封裝的益生菌不受損傷。益生菌需要在胃中穩(wěn)定，在腸道釋放，并且需要在腸黏液層定植才能發(fā)揮生理作用。腸黏液層是由富含半胱氨酸巰基的糖蛋白構(gòu)成的疏水凝膠網(wǎng)絡(luò)。為了同時解決益生菌時空釋放和黏附定植的問題，有研究人員使用半胱氨酸修飾氧化魔芋多糖，獲得了同時具有巰基和羧基的巰基化氧化魔芋多糖，和鐵離子可以形成二硫鍵-S-S-和-COO-Fe3＋-COO-共存的雙交聯(lián)水凝膠，該水凝膠在胃環(huán)境中穩(wěn)定，能夠保護(hù)益生菌不受胃酸脅迫，在腸pH值下響應(yīng)性釋放益生菌，釋放后益生菌表面纏結(jié)的巰基化魔芋多糖作為橋梁和富含巰基的黏蛋白發(fā)生巰基化交換反應(yīng)并生成新的二硫鍵，將益生菌牢固地黏附在黏液層上，有效提高了雙歧桿菌的腸道活菌數(shù)和菌群豐度，使益生元魔芋多糖和益生菌協(xié)同調(diào)控腸道菌群平衡，發(fā)揮益生作用。

       3、油凝膠

       油凝膠是液態(tài)油通過添加凝膠劑，自組裝為網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或液態(tài)油結(jié)晶，進(jìn)而形成包含非極性液相的黏彈性三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)材料。常用的凝膠劑有甘油單酯、卵磷脂、蠟等。油凝膠具有疏水性和乳化性，相較于水凝膠，其物理屏障可以更好地隔離水分，提高 益生菌存活率。例如，基于大豆卵磷脂的油凝膠可以提高嗜酸乳桿菌和乳酸雙歧桿菌的存活率。此外，油凝膠只能被腸道中的脂肪酶消化，實現(xiàn)益生菌的腸道靶向遞送。常采用油凝膠與水凝膠結(jié)合形成的雙凝膠，其同時具有親脂性和親水性雙重特性，可以進(jìn)一步提高 益生菌的存活率。研究報道，采用大豆卵磷脂-硬脂酸油凝膠乳液和乳清蛋白水凝膠混合包封嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌，3周和5周后在酸奶中的活菌數(shù)明顯高于游離菌，并且與純油凝膠相比，混合凝膠中的乳清蛋白可以使乳雙歧桿菌的活菌數(shù)提高5.2（lg（CFU/mL））。

       4、納米涂層

       納米涂層是一種包封單個益生菌的方法，因其制備簡單，已成為益生菌納米包封領(lǐng)域的焦點?？梢酝ㄟ^氫鍵、 π-π堆積、邁克爾加成反應(yīng)和席夫堿反應(yīng)形成聚多巴胺納米涂層，封裝單個活細(xì)胞，顯著提高 益生菌的生物利用率。例如有研究人員采用藥用蠶絲蛋白自組裝在大腸桿菌Nissle 1917（EcN）表面形成納米涂層，體外實驗發(fā)現(xiàn)封裝后的EcN在模擬胃液中的存活率提高52 倍，腸道定植能力提高5.8倍，同時藥用蠶絲蛋白天然的抗炎功能進(jìn)一步提升了EcN的腸炎治療能力，起到協(xié)同治療的效果。此外，層層組裝技術(shù)（layer-by-layer，LbL）是制備多層涂層材料的常用方法，已經(jīng)被應(yīng)用于益生菌遞送載體。

       5、乳液

       目前用于封裝益生菌的乳液包括水包油（O/W）乳液、油包水（W/O）乳液、水包水（W/W）乳液和混合型（O/W/O或W/O/W）乳液。采用乳液作為口服遞送系統(tǒng)操作簡單，適于大規(guī)模生產(chǎn)；對熱穩(wěn)定，可使益生菌產(chǎn)品保存較長時間。納米乳液通常是透明的，因為乳液液滴非常小，不會強烈散射光波，所以非常適用于生產(chǎn)透明的食品。其中，皮克林乳液的凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以減少益生菌與胃腸道產(chǎn)物（胃酸、膽鹽等）的接觸，大大提高 益生菌在口服遞送中的穩(wěn)定性。研究表明，在采用乳液封裝益生菌的過程中，益生菌可以在高負(fù)載力下封裝進(jìn)含果膠的O/W高內(nèi)相皮克林乳液中，65 ℃、30 min后未封裝的乳雙歧桿菌幾乎全部死亡，而封裝的益生菌活菌數(shù)為5.31（lg（CFU/mL））。

       6、納米纖維

       納米纖維具有高比表面積，易通過高壓均質(zhì)、酶水解、超聲處理等技術(shù)改性，非常適于益生菌的口服遞送。高壓電場靜電紡絲技術(shù)生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)條件溫和，可以快速獲得直徑小、比表面積大、透氣率高的纖維材料，適于封裝對溫度敏感的益生菌，是納米纖維封裝益生菌的常用方法。研究表明，采用靜電紡絲技術(shù)制備的阿拉伯膠和普魯蘭多糖雜化納米纖維包封乳酸菌，具有較高封裝穩(wěn)定性，封裝后的乳酸桿菌存活率達(dá)到85.4%～97.8%，而冷凍干燥后的存活率為80.9%～89.8%，此外采用靜電紡絲技術(shù)制備的封裝乳酸菌具有更好的貯藏穩(wěn)定性，4 ℃貯藏28 d后，存活率仍在70%以上。

       7、孢子

       孢子是細(xì)菌的休眠形式，具有多層疏水蛋白質(zhì)外殼，可以保護(hù)細(xì)菌免受胃酸侵害，并且在腸道中發(fā)芽釋放，非常適合于益生菌的口服遞送。孢子在益生菌遞送中的應(yīng)用分為兩種，一種是將益生菌轉(zhuǎn)化為孢子形式封裝，但天然孢子具有難以控制體內(nèi)發(fā)芽效率的缺點，目前已經(jīng)開發(fā)出人工孢子：通過β-環(huán)糊精和金剛烷介導(dǎo)的主客體相互作用，將葡聚糖包裹在丁酸梭菌孢子外形成人工孢子，該人工孢子在厭氧的腸道環(huán)境中會復(fù)活，分解葡聚糖并特異性地富集在腫瘤組織周圍，產(chǎn)生抗癌短鏈脂肪酸，抑制腫瘤生長。另一種是提取孢子殼中的有效成分并用其封裝益生菌，孢子殼納米材料具有極強的極端環(huán)境（強酸、強堿、模擬胃腸液）耐受性，并且可以降低腸道ROS水平，極大程度抵抗惡劣環(huán)境，保護(hù)益生菌。

       8、生物膜

       生物膜可以提高 益生菌的附著能力，隔絕抗生素等外界環(huán)境的侵?jǐn)_。通過枯草芽孢桿菌分泌的胞外多糖和蛋白質(zhì)形成固體生物膜封裝枯草芽孢桿菌，可顯著提高枯草芽孢桿菌的胃腸道耐受性、生物利用度和腸道定植能力。研究報道在磷酸鈣緩沖溶液中通過二油酰磷脂酸和膽固醇制備脂質(zhì)膜封裝EcN，封裝后的EcN顯示出極高的強酸、強堿、模擬胃腸液、抗生素和乙醇抗性，胃部存活率比未包封的EcN高出近3 倍。

       遞送手段的評價方式

       優(yōu)質(zhì)的靶向益生菌遞送系統(tǒng)是能夠在胃和小腸等特殊生理環(huán)境中維持益生菌的完整性和活性，并在結(jié)腸等部位靶向釋放益生菌。目前主要通過各種體外或體內(nèi)釋放效率評估實驗來評估靶向益生菌遞送系統(tǒng)的優(yōu)劣。

       1、溶出度實驗

       溶出度指活性益生菌、藥物等從片劑、膠囊劑或顆粒劑等制劑在規(guī)定條件下溶出速率和溶出程度。溶出度測試是評估靶向益生菌遞送系統(tǒng)使用最廣泛的方法之一，具有重復(fù)性好、精準(zhǔn)度高等特點。最新的Vision 溶出度儀系列可使用轉(zhuǎn)籃法、槳法、槳-碟法、轉(zhuǎn)筒法、小杯法、大杯法等來評估不同聚合物材料制備的靶向益生菌遞送系統(tǒng)。目前常用動力學(xué)模型包括零階模型、一階模型、Higuchi 模型、Ritger-Peppas模型和 Weibull 模型來研究負(fù)載在不同靶向載體中生物活性物質(zhì)的釋放機理。

       體外溶出度實驗過程中，常采用不同 pH 值的緩沖液來模擬胃腸液，然而該實驗無法精準(zhǔn)反映靶向益生菌遞送系統(tǒng)在人類胃腸道的真正釋放性能。近年來，相關(guān)學(xué)者添加胃蛋白酶、胰蛋白酶、和 β-葡萄糖苷酶等至模擬胃腸液中，或添加動物盲腸內(nèi)容物或人類糞便至釋放介質(zhì)中進(jìn)行遞送系統(tǒng)體外釋放研究，研究發(fā)現(xiàn)改良后釋放介質(zhì)中的包埋成分體外釋放率顯著升高。但是，胃腸道非常復(fù)雜，即使存在相關(guān)的酶，模擬培養(yǎng)基也無法準(zhǔn)確代表體內(nèi)胃腸道的真實環(huán)境，因此選擇合適的培養(yǎng)基以準(zhǔn)確評估靶向載體中益生菌的釋放曲線至關(guān)重要。

       2、細(xì)胞實驗

       細(xì)胞體外模型實驗也是評價益生菌遞送系統(tǒng)的重要手段，如評估益生菌遞送系統(tǒng)及釋放的益生菌對正常細(xì)胞或癌細(xì)胞等的殺傷性能、免疫性能。也可通過構(gòu)建細(xì)胞模型，評價聚合物載體保護(hù)益生菌或藥物等活性物質(zhì)在胃腸道被物理化學(xué)作用破壞的情況、細(xì)胞攝取方式的變化以及對胃腸道上皮緊密連接的作用等。如利用 Caco-2 細(xì)胞模型研究載體材料的毒性和及其被細(xì)胞吸收、外排機制，建立 MDCK 細(xì)胞單層跨膜轉(zhuǎn)運模型，綜合分析遞送系統(tǒng)在細(xì)胞表面的吸附，被細(xì)胞內(nèi)吞及跨膜轉(zhuǎn)運機制。

       3、成像實驗

       活體成像、熒光成像等成像技術(shù)為評價藥物遞送系統(tǒng)提供了一種高效、實時、直觀的新方法，可評估所遞送的生物活性物質(zhì)的部位特異性、生理功效以及其釋放行為。例如，利用多光譜熒光成像可以有效實現(xiàn)藥物載體材料、負(fù)載藥物、腫瘤細(xì)胞等的實時成像及監(jiān)控，并可以實時動態(tài)揭示藥物釋放與疾病治療效果的相關(guān)性，為更高效的藥物遞送系統(tǒng)設(shè)計提供研究基礎(chǔ)。基于光學(xué)成像技術(shù)的益生菌體內(nèi)示蹤技術(shù)也可通過同一組實驗動物對象在不同的時間點進(jìn)行記錄檢測，示蹤封裝的益生菌在體內(nèi)胃腸道的變化，避免了體外實驗的繁瑣，效率高且無創(chuàng)傷性。有研究通過X射線成像技術(shù)評價結(jié)腸靶向遞送系統(tǒng)在胃腸道的耐受性及崩解率，證實了該成像技術(shù)監(jiān)測結(jié)腸靶向微球變化的可行性。此外，還有相關(guān)研究使用熒光圖像分析儀監(jiān)測標(biāo)記有 FITC 的微膠囊或藻酸鹽-殼聚糖微球在體內(nèi)的靶向遞送軌跡。

       4、離體實驗

       益生菌具有抑菌、抗炎、調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡、分泌細(xì)菌素等多種功能。為了保護(hù)益生菌的活性及生物利用度，相關(guān)學(xué)者利用離體實驗對靶向益生菌遞送系統(tǒng)進(jìn)行了大量研究，主要集中在利用組織切片、胃腸道離體組織培養(yǎng)等技術(shù)評估靶向益生菌遞送系統(tǒng)的粘膜黏附特性及其負(fù)載的益生菌生物活性物質(zhì)對腸道等患病器官的影響等方面。如通過測定果膠和聚合體材料（聚乙烯吡咯烷酮）的離體黏膜黏附強度來研究其粘膜黏附特性。有研究利用三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎評估"殼聚糖-Ca-藻酸鹽"遞送系統(tǒng)裝載的"干酪乳桿菌01+低聚果糖+菊粉"合生素的抗炎活性。病理切片結(jié)果表明裝載在遞送系統(tǒng)中的合生素在改善結(jié)腸粘膜炎性浸潤、緩解結(jié)腸炎疾病方面顯示出更好的療效，MPO 活性值降低了3.5 倍，初步表明遞送系統(tǒng)顯著改善干酪乳桿菌 01 的細(xì)胞的活力及其生物利用度。此外，通過離體胃腸道（胃、十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸）組織培養(yǎng)技術(shù)也表明基于乳清蛋白分離物 WPI的微膠囊對 FITC 標(biāo)記的發(fā)酵乳桿菌 39-183 具有出色的保護(hù)作用，最大限度的弱化了胃酸的殺菌作用，并使到達(dá)回腸、結(jié)腸中益生菌的數(shù)量達(dá)到最大化。

       參考資料

       [1]朱荻,陳莎男,梅曉宏,等.提高 益生菌耐加工貯藏穩(wěn)定性和體內(nèi)存活率的遞送系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2023,44(21):1-13.

       [2]賈國超,陳曉鳳,張軍,等.基于聚合物載體的益生菌遞送系統(tǒng)：載體類型、性能評價及新技術(shù)應(yīng)用[J].現(xiàn)代食品科技,2022,38(07):338-344.

       作者簡介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事營養(yǎng)食品的開發(fā)與研究。